论文部分内容阅读
研究背景:肺癌是最常见的恶性肿瘤之一,其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）占到了大约85%,而肺腺癌属于非小细胞肺癌,其占肺原发性恶性肿瘤的40%左右。大多数肺腺癌患者的死亡与转移有关,而上皮-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是恶性肿瘤转移的重要原因。有氧糖酵解在肺腺癌进展中起重要作用,有氧糖酵解增强是促进细胞生长和转移的重要因素。腺苷酸激活蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）是一种细胞能量受体,在能量应激期间被磷酸化。低AMPK显著增强癌细胞的糖酵解作用,进而诱导EMT并增强其侵袭和迁移。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）不仅在细胞生长和增殖中起关键作用,而且在细胞代谢中也起重要作用。AMPK磷酸化抑制m TOR活性,从而抑制下游靶点核糖体S6蛋白激酶1和真核翻译起始因子-4E结合蛋白1,后者主要通过调节翻译和蛋白质合成参与细胞生长。Apoptin是鸡贫血病毒（chicken anaemia virus-,CAV）VP3基因的产物。它是一种13.6 k Da的小蛋白,能够选择性地杀死多种人类肿瘤或转化细胞,对正常细胞没有毒性作用。在之前的研究中,我们构建了一种表达人5型腺病毒Apoptin的病毒载体,并将其命名为Ad-apoptin。与传统的转染试剂相比,这种输送系统已被证明能有效地在细胞中表达Apoptin蛋白。然而,Ad-apoptin抑制肺癌的机制尚不完全清楚。研究目的:本研究探讨Ad-apoptin对肺腺癌细胞增殖、凋亡、有氧糖酵解、迁移和侵袭等生物学功能的影响,揭示Ad-apoptin与AMPK之间的调控关系,进一步阐明Ad-apoptin抑制肺腺癌有氧糖酵解及其恶性进展的机制。材料和方法:（1）体外实验:1)通过CCK-8和结晶紫染色实验确定Ad-apoptin对肺腺癌细胞增殖能力的影响;2)应用JC-1染色、Annexin V-m Cherry染色、Annexin V-FITC/PI染色和Western Blot实验检测Ad-apoptin对肺腺癌细胞凋亡的影响;3)通过伤口实验和Transwell小室实验检测Ad-apoptin对肺腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;4)应用Western Blot实验和细胞免疫荧光染色检测Ad-apoptin对肺腺癌细胞EMT相关标志蛋白的影响;5)通过GEPIA数据库和Kaplan-Meier数据库检索有氧糖酵解相关激酶分别在正常肺部组织和肺癌组织中的表达水平;6)采用试剂盒检测Ad-apoptin对肺腺癌葡萄糖摄取和乳酸生成的影响;7)通过Western Blot实验和细胞免疫荧光染色检测Ad-apoptin对肺腺癌细胞糖酵解关键激酶和葡萄糖转运蛋白GLUT-1的影响;8)通过Co-IP实验检测Ad-apoptin与AMPK蛋白间相互作用;9)检测敲低AMPK后,Ad-apoptin对肺腺癌细胞糖酵解、迁移和侵袭的影响。（2）体内实验:1)应用慢病毒转染、构建敲低AMPK的稳转细胞系;2)建立裸鼠皮下荷瘤模型,检测Ad-apoptin对肿瘤的体积以及裸鼠存活率的影响;3)通过H＆E染色检测Ad-apoptin对裸鼠组织结构的影响;4)通过免疫组化检测Ad-apoptin对不同组别瘤体组织中Ki-67、TUNEL、糖酵解、迁移和侵袭相关标志蛋白表达的影响。结果:（1）体外实验:1)CCK-8和结晶紫染色结果表明Ad-apoptin以剂量依赖性和时间依赖性抑制肺腺癌细胞的增殖;2)JC-1染色、Annexin V-m Cherry染色和Annexin V-FITC/PI染色结果表明Ad-apoptin可诱导肺腺癌凋亡,Western Blot实验结果显示Ad-apoptin诱导凋亡蛋白Cleaved-PARP与Cleaved Caspase-3上调;3)Ad-apoptin可诱导肺腺癌细胞Vimentin、Fibronectin、N-cadherin、Snail和MMP9蛋白的下调,上调E-cadherin蛋白的表达,细胞免疫荧光检测结果与之一致;4)通过GEPIA数据库和Kaplan-Meier数据库检索发现糖酵解关键激酶PKM2、LDHA、HK2及糖转运蛋白GLUT-1在肺癌中均高表达,与生存率呈负相关,具有统计学意义;5)Ad-apoptin抑制肺腺癌细胞葡萄糖摄取和乳酸生成,Western Blot结果显示,Ad-apoptin抑制糖酵解关键蛋白（HK1、HK2、PKM1、PKM2和LDHA）和葡萄糖转运蛋白GLUT-1的表达,细胞免疫荧光检测结果与之一致;6)Ad-apoptin降低肺腺癌细胞p-m TOR、p-p70S6K和p-4E-BP1蛋白的表达,上调p-AMPK蛋白的表达;Co-IP结果表明,外源性Apoptin被AMPK沉淀,AMPK是Apoptin作用的靶点;7)敲低AMPK可以减弱Ad-apoptin抑制肺腺癌细胞糖酵解、迁移和侵袭能力。（2）体内实验:1)Ad-apoptin治疗使肿瘤体积显著减小,小鼠存活时间延长;2)H＆E结果显示,Ad-apoptin组细胞核溶解、固缩,细胞质内空泡增多;免疫组化结果表明,与Control组和Ad-mock组相比,Ad-apoptin组Ki-67阳性率降低,而TUNEL阳性率升高;Ad-apoptin组p-4E-BP1、N-Cadherin、GLUT-1和LDHA的表达降低;相反,p-AMPK和E-Cadherin的表达升高,这与体外结果一致;3)Western Blot和q RT-PCR结果显示成功构建A549细胞sh AMPK稳转株,不同组别裸鼠皮下移植模型中,sh AMPK+Ad-apoptin组和Ad-apoptin组之间的肿瘤体积和存活率存在显著差异,与Ad-apoptin组相比,sh AMPK+Ad-apoptin组的Ki-67阳性率和p-AMPK的表达较高,TUNEL阳性率和p-m TOR的表达较低,这与体外结果一致。结论:Ad-apoptin通过靶向AMPK激活AMPK/m TOR信号通路,进而抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移侵袭和糖酵解能力。此外,我们发现在裸鼠皮下移植模型中,腹腔注射Ad-apoptin可显著减少裸鼠肿瘤的体积,延长裸鼠存活时间。