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目的本研究通过构建带有高斯荧光素酶报告基因（Gaussia luciferase;Gluc）的流感病毒A/Puerto Rico/8/1934（H1N1）,建立抗流感药物高通量表型筛选体系,并以来源于中药的天然产物库及其衍生物为研究对象进行抗病毒活性筛选及作用机制探究,为抗病毒的新药研发提供先导化合物。方法1.带有荧光素酶报告基因的流感病毒的包装。以反向遗传技术为基础,将流感病毒的 8 个质粒 pDZ-PB2-Gluc、pDZ-PB1、pDZ-PA、pDZ-HA、pDZ-NP、pDZ-NA、pDZ-M、pDZ-NS转染至共孵育的293T和MDCK细胞包装病毒,并用9日龄鸡胚扩增PR8-PB2-Gluc病毒。2.高通量筛选体系的建立与验证。PR8-PB2-Gluc病毒以不同感染复数（Multiplicity of infection;MOI）感染MDCK细胞,根据荧光素酶表达量确定最佳感染剂量及检测时间。通过信噪比、变异因子、Z’Factor指标评估该高通量筛选的适用性,并用四种不同靶点的阳性药或化合物（compound 16、巴洛沙韦、奥司他韦、利巴韦林）验证该筛选体系的敏感性。3.活性化合物的筛选。高通量表型筛选体系检测来源于中药诃子的12种化合物、800种天然产物和110天然产物衍生物的抗流感效果,挑选病毒抑制率大于80%且细胞毒性小于20%的化合物,并进一步检测活性化合物在不同浓度下的抑制作用及细胞毒性,拟合活性化合物的半数有效浓度（50%inhibitory concentration;IC50）及半数毒性浓度（50%cytotoxic concentration;CC50）,并计算活性化合物的选择指数（Selectivity index;SI）。4.活性化合物对不同亚型流感病毒的抑制作用。为了探究活性化合物抗流感的广谱性,通过病毒滴度降低实验检测化合物对流感病毒株A/PR/8/34（H1N1）、耐达菲株 A（H1N1）pdm09、A/Brisbane/10/2007（H3N2）、A/Wyoming/3/03（H3N2）和两株乙型流感病毒Yamagata和Victoria株的抑制作用。5.安石榴苷的作用机制。单周期复制实验判断安石榴苷的大致作用阶段:病毒释放抑制实验和神经氨酸酶抑制实验判断安石榴苷是否影响神经氨酸酶介导的病毒释放阶段。6.甘松新酮的作用机制。加时实验判断甘松新酮作用于流感病毒的大致阶段,免疫荧光实验进一步印证该结果。最后,RNA依赖的RNA聚合酶实验证明甘松新酮是否影响流感病毒的复制阶段。7.查尔酮类衍生物A9的体内抗流感作用。BALB/c雌性小鼠滴鼻感染PR8病毒,感染病毒前2 h腹腔注射10 mg/kg/day和30 mg/kg/day。分别在第2天和第5天检测小鼠肺组织的病毒载量。8.查尔酮类衍生物A9的作用机制研究。首先利用加时实验判断化合物的大致作用阶段;免疫荧光实验评估化合物对流感病毒NP蛋白含量及定位的影响;将细胞核与细胞质分离后,利用Western Blotting实验对核质中NP蛋白含量进行定量分析;耐药株突变实验确定化合物的具体结合位点。9.查尔酮类衍生物A9系列结构修饰物的活性检测。对A9化合物的A环和B环结构进行取代,共修饰合成34个化合物,测定化合物的活性并用免疫荧光实验验证作用机制。结果1.高通量筛选体系的成功建立与验证。本研究成功包装带有高斯荧光素酶报告基因的流感病毒PR8-PB2-Gluc并建立高通量表型筛选体系。高通量评价指标（信噪比=45.09、变异因子=9.51%、Z’Factor=0.70）表明该体系适用于高通量筛选;4种不同作用机制的化合物或药物在该体系中均呈现剂量依赖性的抗流感作用,证明该体系对不同靶点的药物具有敏感性。2.安石榴苷、甘松新酮及查尔酮类衍生物A9具有抗PR8-PB2-Gluc活性。利用高通量筛选体系发现安石榴苷、甘松新酮及查尔酮类衍生物A9能够显著抑制流感病毒的复制,IC50值分别为 1.25±0.06μM、0.35±0.05 μM 和 3.51±0.37μM;CC50 值分别为＞100.00 μM、＞100.00μM和41.46±9.35μM,SI 值为＞80.00、＞285.71 和 11.81。3.安石榴苷和查尔酮类衍生物A9具有广谱抗流感活性。病毒滴度降低实验表明,安石榴苷和查尔酮类衍生物A9对甲型H1N1流感病毒株A/PR/8/34（H1N1）、耐达菲株 A（H1N1）pdm09、A/Brisbane/10/2007（H3N2）、A/Wyoming/3/03（H3N2）和两株乙型流感病毒Yamagata和Victoria株具有抑制作用,且呈现剂量依赖性关系。4.安石榴苷的作用机制。单周期复制实验结果表明安石榴苷未影响流感病毒的入侵和复制阶段;病毒释放抑制实验、神经氨酸酶抑制实验表明安石榴苷的作用机制是通过抑制神经氨酸酶的活性来阻断病毒的释放;分子对接实验进一步推测安石榴苷与神经氨酸酶可能的结合位点。5.甘松新酮的作用机制。甘松新酮类似物异甘松新酮、百秋李醇具有抗流感活性。加时实验证明甘松新酮作用于流感病毒的入侵阶段,免疫荧光实验进一步印证该结果。最后,RNA依赖的RNA聚合酶实验证明甘松新酮未影响流感病毒的复制阶段。6.查尔酮类衍生物A9的体内抗流感活性。查尔酮类衍生物A9在30 mg/kg/day时,化合物在第2天和第5天对小鼠肺组织病毒载量的抑制率分别为38.60%和61.40%。该结果表明A9能够显著降低肺组织的病毒载量,具有体内抗流感活性。7.查尔酮类衍生物A9的作用机制。加时实验表明A9作用于流感病毒的入侵后阶段。免疫荧光实验探讨A9对病毒核糖核蛋白复合体核输出的影响,阐明A9抑制RNP出核。为了进一步量化该实验结果,MDCK和A549细胞感染病毒并用药物处理后,将细胞核与细胞质分离,利用Western Blotting分别定量核质中的NP蛋白,进一步证实A9在两株不同的细胞中均能够抑制RNP复合体的出核。最后,通过耐药株突变实验,分离出A9耐药株,NP基因组片段测序鉴定出突变位点为N397S。利用反向遗传技术包装该突变病毒PR8N397S,与A9对野生型PR8的效果相比,A9对突变株的抑制效果显著降低,表明A9的结合位点可能与RNP复合体中的NP蛋白的397位点相关。8.查尔酮类衍生物A9系列结构修饰物的活性测定。本研究对A9化合物的A环和B环结构进行修饰,首先对B环的两个甲氧基进行取代,共修饰合成22个化合物,22个化合物的筛选结果显示化合物F1 1的活性最佳,其IC500和CC50值分别为13.63±9.06和59.54±12.42μM。F11的活性比A9弱4倍左右,推测A9的B环结构在发挥抗流感活性起关键作用,因此保留A9的B环结构并对A9的川芎嗪环A替换,共修饰合成12个化合物,12个化合物的筛选结果显示JZ-57和JZ-63的抗流感效果最优,IC50分别为2.96±0.17和2.46±0.54 μM,CC50值分别为16.65±5.70和11.34±1.10μM,两个修饰物的活性稍优于A9。免疫荧光实验确定三种修饰物的作用机制与A9相同,能够抑制流感病毒NP蛋白的出核,发挥抗流感作用。结论1.本研究利用带有报告基因的流感病毒PR8-PB2-Gluc成功构建抗流感药物高通量表型筛选体系。该体系能够筛选发现不同靶点的抑制剂,具有灵敏、高效、信噪比高等优势。2.利用抗流感高通量表型筛选体系,发现安石榴苷具有抗流感活性。安石榴苷对甲型流感病毒（包括H1N1的H274Y耐达菲株）和乙型流感病毒具有剂量依赖性抑制作用,其作用机制是干扰流感病毒的神经氨酸酶活性,表明安石榴苷是一种靶向于神经氨酸酶的广谱抗流感抑制剂。3.本研究发现甘松新酮及其类似物异甘松新酮和百秋李醇具有抗流感活性,甘松新酮能够抑制流感病毒的入侵过程,且未影响流感病毒的转录和复制阶段。4.本研究发现4个查尔酮类衍生物（A9、F11、JZ-57和JZ-63）能够抑制流感病毒核糖核蛋白的出核,并且A9与NP蛋白的397位点产生作用。该类查尔酮类衍生物对甲型（包括H274Y耐达菲株）和乙型流感病毒均具有抑制作用,表明该类衍生物是一种靶向于NP蛋白的广谱抗流感抑制剂。