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背景和目的:Na+-K+-2Cl-共转运体(NKCC)是阳离子一氯化物共转运体超家族中的一员,负责将细胞外的1Na+、1K+、2Cl-以电中性的方式转运入细胞内。NKCC在维持细胞离子的动态平衡、细胞体积的调控,以及调节离子的跨上皮转运过程中发挥着重要的作用。目前已鉴定出两种NKCC亚型,即NKCC1和NKCC2。NKCC1广泛地分布在几乎所有的组织细胞类型中,参与多种重要的生理功能;而NKCC2一直被视为是肾脏特异的共转运体,与水盐吸收关系密切。前期研究发现NKCC2表达在大鼠的整个胃肠道,特别是在胃粘膜的分布,但关于其在胃粘膜的细胞学定位及功能仍不清楚。由于以往对NKCC在胃组织中的表达并没有进行亚型的区分,导致功能学研究上一直存在很大的争议。因此,本研究的目的在于揭示NKCC2在胃粘膜的细胞学定位,从渗透敏感性以及胃酸分泌两个方面对其功能进行探讨。由于NKCC两种亚型间的高度同源性,在研究NKCC2的同时,也对NKCC1的特征进行比较研究,从而更好地阐明NKCC2的生理特性,进而明确两种亚型各自的功能意义。
方法:本研究中主要采用大鼠、小鼠以及人的胃粘膜,应用RT-PCR、Westernblot和免疫荧光技术鉴定NKCC1和NKCC2的表达和分布。应用大鼠胃粘膜观察在不同渗透压刺激下NKCC1和NKCC2的表达改变。应用小鼠胃粘膜和原代培养的大鼠胃上皮细胞,采用实时pH滴定、Westernblot、免疫共沉淀和免疫荧光技术,研究NKCC在胃酸分泌中的作用和可能机制。
结果:(1)NKCC1和NKCC2在大鼠、小鼠及人的胃粘膜中均有表达并呈现出不同的表达方式。NKCC1主要表达在壁细胞和主细胞中,而在粘液细胞中表达较弱;NKCC2在壁细胞和粘液细胞中有强阳性表达,而在主细胞中的强度明显减弱。(2)提高细胞外液渗透压可以明显上调NKCC1的mRNA水平和蛋白水平,同时促进其膜转位;而NKCC2的mRNA水平在低渗状态下明显增高,蛋白水平在高渗状态下明显降低,并不伴随有膜转位的产生。(3)NKCC1表达在壁细胞的基底外侧膜,而NKCC2表达在顶端膜。(4)在胃粘膜层的顶膜侧加入NKCC的阻断剂bumetanide(10μM),可以明显抑制forskolin和histamine引起的胃酸分泌;而在基侧膜加入bumetanide(10μM),forskolin引起的酸分泌率无明显改变。Histamine短期刺激不能引起NKCC2蛋白水平的改变,但却可以促进NKCC2向细胞顶膜的转移。无论是在静息状态下还是刺激状态下,都未检测到NKCC2和H+/K+-ATPase之间的相互作用。用histamine刺激原代培养的壁细胞,发现与静息状态相比,NKCC2有向细胞膜转移的趋势。
结论:(1)NKCCl和NKCC2不同程度地表达在哺乳动物的壁细胞、主细胞和粘液细胞中。(2)NKCC2与NKCC1在不同渗透压刺激下,二者的功能可能具有互补性。(3)NKCC2而非NKCC1参与了胃酸的分泌过程。