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食品中的重金属污染是造成食品安全问题的主要原因之一。铅是一种广泛存在的环境重金属污染物,可以通过多种途径进入食品,进而对人体健康造成威胁。近年来随着人们食品安全意识的增强,急性铅中毒的发生得到有效控制,而以长期低剂量暴露模式为主的食源性铅暴露逐渐成为食品安全和公共卫生领域关注的热点。许多研究表明慢性铅暴露会损伤发育期神经系统的结构和功能,其损伤机制多样而复杂,其中表观遗传学(Epigenetics)调控为解析铅致神经毒性的分子机制提供了新思路,然而RNA表观遗传修饰N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine,m6A)在铅暴露导致的神经毒性过程中发挥什么样的作用尚不清楚。目的1.探究慢性铅暴露导致神经毒性的过程中是否有m6A的参与;2.阐明m6A甲基化转移酶METTL3在铅致神经毒性的过程中所起的调控作用;3.探究铅暴露后神经细胞m RNA转录本中m6A的分布情况的变化;4.识别在该食品毒理学过程中受m6A调控的功能基因谱系;方法1.以Sprague-Dawley(SD)大鼠为动物模型,通过水迷宫、Y迷宫行为学实验及H&E染色、尼氏染色病理学实验,探究慢性铅暴露对发育期大鼠神经系统的病理及神经行为损伤;2.随后以原代海马神经元为体外模型进行进一步的分子机制研究,采用斑点印迹法(Dot-blot)、免疫细胞化学(ICC)及m6A定量试剂盒检测法评估铅暴露后细胞总体m6A水平的变化,并通过荧光定量PCR、Western蛋白印迹法评估铅暴露后细胞中m6A修饰相关酶的转录水平与蛋白水平;3.以大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)为神经元模式细胞,sh METTL3处理PC12细胞后,观察并统计分析sh METTL3处理对铅暴露引起的细胞突起生长损伤中的影响,并采用Western蛋白印迹法检测sh METTL3处理对铅暴露后突触后致密蛋白-95(PSD-95)表达的影响;4.通过m6A测序(Me RIP-seq)与转录组测序(RNA-seq)联合分析研究神经元细胞中受铅影响所引起的基因表达重塑。结果1.慢性铅暴露损伤大鼠神经系统形态和功能:神经行为学和病理学实验结果显示,慢性铅暴露导致大鼠海马依赖的空间学习记忆能力受损且神经系统出现病理性损伤;2.铅暴露扰动神经元细胞中m6A整体水平:Dot-blot、ICC、m6A定量试剂盒的实验结果显示,与正常对照组相比,铅暴露后神经元细胞中总体m6A水平上升;荧光定量PCR、Western蛋白印迹结果显示与m6A相关的甲基化转移酶METTL3表达水平上调,而其余与m6A修饰相关的酶的蛋白表达水平则没有显著变化;3.METTL3在铅介导的神经毒性过程中发挥重要作用并调控下游基因的转录和表达水平:观察和统计分析结果显示,与铅暴露组相比,sh METTL3处理可回复铅导致的细胞突起生长损伤;Western蛋白印迹结果显示,sh METTL3处理挽救铅导致的PSD-95表达水平的降低;4.铅暴露通过影响磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B信号通路(PI3K-AKT pathway)相关基因的m6A水平影响其转录水平,并抑制PI3K-AKT信号通路的激活:RNA-seq与Me RIP-seq结果显示铅暴露改变神经元细胞转录谱及m6A甲基化谱;联合分析结果显示铅暴露同时影响m6A水平及m RNA表达水平的基因富集在PI3K-AKT信号通路上,筛选出的关键基因为CREB3L2、ITGB5、HSP90b1;荧光定量PCR和Me RIP-q PCR的结果验证了这些基因的m6A水平及转录水平;Western蛋白印迹结果显示铅暴露抑制了磷酸化AKT(p-AKT)的蛋白表达。结论表观遗传调控m6A参与并介导了铅导致的神经毒性;其机制可能是由于m6A调控铅暴露后PI3K-AKT信号通路相关基因的m RNA表达水平,以此抑制PI3K-AKT信号通路的激活,从而介导铅的神经毒性。该研究首次揭示了新颖的RNA表观遗传调控模式m6A甲基化在铅神经毒性中的作用,并探究了其上下游的分子机理细节,为进一步深入解析铅致神经毒性的机理、识别新的效应标记物并维护食品安全提供理论依据。