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缺血性脑血管病是我国死亡原因前 6 位重大疾病中的第一杀手,深入探讨其发病机制有重要的意义。近年研究表明炎症机制在脑缺血/再灌注损伤发生发展过程中起重要作用,抗炎治疗已经成为缺血性脑血管病的干预手段之一。脑缺血后炎症的组织学特征是白细胞浸润,而细胞因子、粘附分子、炎症介质和转录因子在此病理过程中起关键作用。细胞因子、粘附分子、转录因子和白细胞浸润之间显示明显的链锁关系,此即所谓的炎症级联反应。 异亚丙基莽草酸(3,4-oxo-isopropylidene shikimic acid,ISA)是从中药八角属植物八角茴香中提取的有效成分莽草酸(shikimic acid,SA)的合成衍生物,研究表明 ISA能够明显抑制多种诱导剂所致的血小板聚集以及实验性血栓的形成,抑制血管内皮细胞的活化,对局灶性脑缺血具有良好的保护作用。本文采用酶联免疫分析、放射免疫测定、免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应等手段,从血脑屏障的破坏、脑水肿的产生、白细胞的浸润、细胞因子粘附分子表达、环氧合酶激活以及转录因子活化等炎症环节探讨了ISA 对大鼠暂时性大脑中动脉阻塞(tMCAO)模型炎症反应的干预作用及可能的作用机理。 1 异亚丙基莽草酸对脑缺血再灌注大鼠神经元的保护作用 目的:研究 ISA 对脑缺血再灌注大鼠神经症状、脑梗死范围、血清 NSE 含量和脑病理形态学改变的影响。方法:参照 Koizumi 与 Nagasawa 方法制作 tMCAO 大鼠模型,按照 Zea Longa 5 级评分法于术后 3 h、6 h 和 24 h 进行神经病学症状评分,术后 24 h 以放射免疫法测定血清中神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量,以 TTC 染色法测定脑梗死范围,以 HE 染色进行病理形态学观察。结果:tMCAO 大鼠出现了明显的神经缺损症状和大面积脑梗死,血清 NSE 含量显著升高,神经元大量变性坏死或脱失,间质水肿,白细胞浸润。ISA 200 mg/kg、ISA 100 mg/kg 可明显降低模型大鼠的神经病学症状分值和血清 NSE 含量,减小脑梗死范围,减轻脑组织病理性损害。结论:ISA 能够减轻神经元的缺血性损伤。 2 异亚丙基莽草酸对脑缺血再灌注大鼠炎症反应的干预作用 目的:探讨 ISA 对 tMCAO 大鼠血脑屏障、脑水肿以及白细胞浸润的影响。方法:以伊文思蓝、IgG 通透性实验测定脑微血管的通透性变化,以基质金属蛋白酶-9 (MMP-9)免疫组化测定反映脑微血管的破坏情况,以干湿重法测定脑组织含水量的变化,以脑组织髓过氧化物酶(MPO)活性测定反映白细胞浸润情况。结果:tMCAO 大鼠脑微血管对伊文思蓝和 IgG 表现出明显的通透性,MMP-9 大量表达;脑组织含水量明显增加,MPO 活性显著增强。ISA 200 mg/kg、ISA 100 mg/kg 能显著降低 tMCAO 大鼠脑微血管的通透性,伊文思蓝含量和 IgG 表达明显降低;ISA 200 mg/kg 能够显著降低2 异亚丙基莽草酸抗大鼠脑缺血再灌注损伤的炎症机制研究脑微血管 MMP-9 的阳性表达面积以及积分光密度;ISA 200 mg/kg、ISA 100 mg/kg 能显著降低 tMCAO 大鼠脑含水量和 MPO 活性,改善脑水肿并减少白细胞的浸润。结论I:SA能够显著减轻脑缺血再灌注所引发的炎症反应。3 异亚丙基莽草酸对脑缺血再灌注大鼠粘附分子表达的影响目的:观察 tMCAO 大鼠脑组织细胞间粘附分子-1(ICAM-1)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、巨噬细胞抗原复合体-1(Mac-1)表达的变化以及 ISA 的影响。方法:脑缺血 3 h 再灌注 21 h,tMCAO 大鼠以多聚甲醛心脏灌注取脑,石蜡包埋切片,进行ICAM-1、LFA-1 及 Mac-1 的免疫组织化学染色,显微镜下观察及图像分析。结果:脑缺血再灌注后 ICAM-1 在脑微血管内皮细胞大量表达,LFA-1 及 Mac-1 在浸润于脑组织的白细胞大量表达。ISA 200 mg/kg 可显著降低模型大鼠 ICAM-1 阳性表达的血管数、阳性面积以及积分光密度,显著降低 LFA-1 的阳性面积、积分光密度及 Mac-1 的积分光密度。结论:ISA 能够显著下调脑缺血再灌注后粘附分子的表达。4 异亚丙基莽草酸对脑缺血再灌注大鼠炎性细胞因子表达的影响目的:研究 ISA 对 tMCAO 大鼠脑组织中白介素 1β(IL-1β)、白介素 8(IL-8)、肿瘤坏死因子 α(TNF-α)的含量以及 IL-8 mRNA 表达的影响。方法:脑缺血 3 h 再灌注21 h,制作脑组织匀浆,取上清液以 ELISA 法测定其中 IL-1β、IL-8、TNF-α 的含量;取缺血区脑组织以 RT-PCR 法研究 IL-8 mRNA 的表达情况。结果:tMCAO 大鼠脑组织IL-1β、IL-8、TNF-α 含量以及 IL-8 mRNA 表达明显升高,ISA 200 mg/kg、100 mg/kg 可明显减少模型大鼠脑组织 IL-1β、IL-8、TNF-α 的水平,ISA 200 mg/kg 可显著降低 IL-8mRNA 的表达。结论:ISA 可显著降低脑缺血再灌注后炎性细胞因子的高表达。5 异亚丙基莽草酸对脑缺血再灌注大鼠环氧合酶表达的影响目的:研究 ISA 对 tMCAO 大鼠血浆前列腺素 E2(PGE2)的含量以及脑组织环氧合酶-2(COX-2)蛋白和 mRNA 表达的影响。方法:脑缺血 3 h 再灌注 21 h,大鼠颈总动脉取血,分离血浆,以放射免疫法测定 PGE2 的含量;脑组织石蜡切片,以免疫组织化学方法观察 COX-2 蛋白表达;取缺血区脑组织以 RT-PCR 法研究 COX-2 mRNA 的表达。结果:三者在假手术组呈低水平表达,tMCAO 大鼠血浆 PGE2含量显著升高,脑组织 COX-2 蛋白以