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目的：克隆大鼠组织因子(tissue factor，TF)基因，构建真核表达载体pEGFP-N1-TF，转染C6大鼠神经胶质瘤细胞检测转染细胞内TF基因的表达，为研究TF的生物学功能提供实验工具。
方法：设计分别带有KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点的TF基因扩增上、下游引物，采用RT-PCR法从Wistar大鼠肺组织总RNA中获得TF基因全长编码序列。对PCR产物进行胶回收纯化，连接至pMD18-T Simple载体上，连接产物转化JM109感受态细菌，接种至氨苄青霉素抗性的LB平板上，挑选出阳性克隆进行KpnⅠ/BamHⅠ双酶切和PCR鉴定。将插入片段与TF大小一致的阳性克隆和pEGFP-N1质粒用KpnⅠ/BamHⅠ双酶切，胶回收后对两者进行连接，构建含TF基因的重组质粒pEGFP-N1-TF。重组质粒经CaCl2法转化JM109感受态细菌，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。经KpnⅠ，BamHⅠ酶切和PCR反应并测序，鉴定重组质粒中插入的TF基因的完整性和可靠性。将pEGFP-N1-TF重组质粒转入C6细胞，荧光显微镜下观察EGFP报告基因的表达强度和转染效率，并对转染细胞的TF-eGFP融合蛋白进行Western blot检测。
结果：经RT-PCR从Wistar大鼠肺组织总RNA中获得955bp片段大小的TF基因序列。重组质粒pEGFP-N1-TF经酶切及测序鉴定，其插入的TF基因序列与GeneBank数据库中提交的相应序列(NM_013057.2/GI：52138594)吻合。重组质粒转染C6细胞后，荧光显微镜下观察其转染效率在20％-30％左右，荧光表达主要分布于细胞膜上。Western blot结果显示在转染pEGFP-N1-TF的C6细胞中可以检测到TF-eGFP融合蛋白的表达。
结论：成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-TF，转染C6细胞后获得了良好的瞬时表达。