乙型肝炎病毒(HBV)的慢性感染是世界范围内原发性肝细胞癌(HCC)的主要发病原因之一,其中HBV X片段被认为是导致肝细胞恶性转化的主要因素。HBV-DNA,尤其是HBx基因频繁整合于宿主基因组,导致染色体的不稳定性和插入突变的发生,与HCC的发生密切相关。MicroRNA (miRNA)是一类内源性的,长度约22nt非编码小分子单链RNA。它通过与靶mRNA的3’UTR结合,参与转录后水平调控基因的表达。近来的研究结果证明,miRNA突变和异常表达与各种人体肿瘤发生、发展相关,miRNAs与肿瘤相关性的研究已成为近年来肿瘤研究领域中的一个热点,它被认为是一组新的癌或抑癌基因,具有特异性的肿瘤组织表达谱。研究认为miRNA水平的变化常导致其靶基因的表达异常,从而影响了肿瘤的进程,其表达的模式可作为肿瘤诊断／预后的分子标记。深入研究miRNA在人体肿瘤中的表达状况及其功能,对研究肿瘤的发生、发展和转移的机制具有重要意义,并将有利于肿瘤的诊断、预后及治疗。但现在很少有文献系统的研究与HBx特异相关的miRNA在HBx导致的HCC发生、发展中的作用。我们前期研究已成功构建了稳定表达HBx的肝细胞株(L02/HBx),并通过裸鼠成瘤实验证实HBx可引起肝细胞癌变,同时发现转染HBx基因后L02细胞的增殖能力与非锚定依赖生长能力明显增强,我们分析HBx促L02细胞恶性转化作用可能与其增强G1期调控相关基因如CyclinD1、CyclinG1、E2F1的表达相关。本研究首先采用Agilent公司生产的miRNA芯片检测转染野生型HBx基因前后L02细胞miRNA表达谱,并筛选出部分差异表达的miRNA,接着阐述通过改变特异性的miRNA的表达是否调节了细胞增殖,特别是对Cyclin基因的调控是本研究的主要内容。本研究从HBx与miRNA入手,探索它们在HBV相关性肝癌的发生发展中的作用及其机制。为进一步理解受HBx影响的纷繁复杂的信号通路提供一定的帮助,试图探讨HBx致癌变新的发病机制。第一章利用芯片技术检测HBx基因对肝细胞miRNA表达谱的影响—下调miR-338-3p的表达目的：研究HBx基因影响L02细胞的miRNA表达谱,筛选出与HBx相关的miRNA。方法：以LO2/pcDNA3.0细胞为对照,采用Agilent公司生产的miRNA芯片技术检测转染了HBx基因后L02细胞miRNA表达谱的变化,并通过Real-time荧光定量PCR (qRT-PCR)验证芯片所得结果,筛选出在LO2/HBx细胞中下调倍数最大的miR-338-3p进行下一步的功能研究。结果：芯片结果显示,与LO2/pcDNA3.0细胞相比,LO2/HBx细胞有4个miRNA表达上调,分别为miR-7、miR-1274a、miR-137、 miR-663;有11个miRNA表达下调,分别为miR-338-3p、miR-551b、miR-24-1*、miR-29c、miR-744、miR-455-3p、miR-324-5p、miR-340、 miR-660、miR-193a-3p、miR-590-5p,其中miR-338-3p下调最为明显,与qRT-PCR验证的结果相一致。结论：①HBx能影响LO2细胞的miRNA表达谱,如下调miR-338-3p的表达；②miRNA芯片技术检测结果可靠,可用于筛选组织、细胞间的miRNA表达谱。第二章miR-338-3p对稳定表达HBx细胞的增殖能力影响目的：第一部分研究已发现HBx可下调miR-338-3p的表达,本部分研究miR-338-3p在HBx致人肝细胞异常增殖中的作用及其相关机制,试图探讨HBx致癌变新的机制。方法：合成特异的miR-338-3p模拟物(mimics)及抑制剂(inhibitor),以相应的阴性对照(NC)作为对照组,通过脂质体转染miR-338-3p mimics/inhibitor到LO2/HBx和LO2/pcDNA3.0细胞中,MTT、Edu检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期。结果：流式细胞仪发现,转染niR-338-3p增加细胞内miR-338-3p表达之后,G1期延长,S期缩短,而与之相反的是转染miR-338-3p inhibitor降低细胞内miR-338-3p的表达后,G1期缩短,S期延长；MTT结果显示,miR-338-3p可以明显抑制细胞增殖,抑制率分别为40%±9.41和34%±8.3；而抑制miR-338-3p在L02/HBx和LO2/pcDNA3.0细胞中的表达,则促进细胞增殖(53%士8.1和38%士7.6)。而Edu结果也表明,miR-338-3p可抑制肝细胞DNA的合成,缩短S期细胞比率。结论：①miR-338-3p可抑制细胞增殖;②miR-338-3p抑制细胞增殖的机制可能是通过延长细胞G1期,抑制肝细胞DNA的合成,缩短S期细胞比率,从而抑制肝细胞的增殖。第三章miR-338-3p靶向调节CyclinDl的机制研究目的：根据课题组前期研究及在第二部分所得结果,我们发现miR-338-3p可调节肝细胞增殖,且在L02/HBx细胞中呈现低表达,与CyclinD1的表达水平成负相关,结合生物信息学分析,发现miR-338-3p可与CyclinD1的3’UTR结合,因此推测CyclinD1极可能为miR-338-3p的目的基因。本部分研究miR-338-3p调节CyclinD1的作用机制。方法：①通过Lipofectamine转染miR-338-3p-mimics/inhibitor到细胞中,Real-time定量PCR、Western Blot检测细胞中CyclinD1mRNA、蛋白表达的改变；②利用PCR方法,扩增CyclinD1-3’UTR序列,同时设计引物突变掉两个miR-338-3p的靶标序列,将其克隆到pmirGLO双荧光素酶报告载体中,构建报告质粒CyclinD1-3’UTR野生型及突变型(分别命名为pCyclinD1-3’UTR-WT、pCyclinD1-3’UTR-Mut);同时为进一步明确具体的调控位点,将上述两个靶标序列分别进行突变,构建报告质粒CyclinD1-3’UTR突变型1和2,分别命名为pCyclinD1-3’UTR-Mutl(突变907-913nt)和pCyclinD1-3’UTR-Mut2(突变2397-2403nt)。将以上报告质粒与miR-338-3p mimics及miR-NC共转染到L02/HBx细胞中,检测荧光素酶表达的改变。结果：①与阴性对照组比较,模拟miR-338-3p表达后,L02/HBx和LO2/pcDNA3.0细胞中CyclinD1蛋白表达下调,反之抑制miR-338-3p表达后,细胞中CyclinD1蛋白表达显著上调,而miR-338-3p对细胞CyclinD1mRNA表达无明显影响。②经PCR扩增、双酶切及测序鉴定pCyclinD1-3’UTR-WT、pCyclinD1-3’UTR-Mut、 pCyclinD1-3’UTR-Mut1和pCyclinD1-3’UTR-Mut2重组质粒构建成功。③与miR-NC相比,miR-338-3p与pCyclinD1-3’UTR-WT共转染可使海肾荧光素酶活性下降,荧光素酶相对比值下降；虽miR-338-3p均可调控两个位点,但以对pCyclinD1-3’UTR-Mutl的作用更为显著。结论：①miR-338-3p可负性调控CyclinD1蛋白表达；②成功构建了CyclinD1-3’UTR报告质粒；③miR-338-3p与CyclinD1-3’UTR结合,靶向调控CyclinD1,这种作用以CyclinD1-3’UTR的2397-2403nt位点最为显著。HBx可通过下调miR-338-3p的表达而调控了肝细胞恶性增殖,建立了HBx致癌变新的发病机制。第四章干扰HBx表达后miR-338-3p及CyclinD1表达的改变目的：我们的研究发现,在稳定表达HBx基因的L02细胞中,HBx通过下调niR-338-3p的表达调控CyclinD1,从而促进肝细胞增殖。那么,抑制了HBx表达后miR-338-3p与CyclinD1的表达是否也发生相应的改变?本研究为进一步证实,miR-338-3p与CyclinD1在肝细胞中的表达依赖于HBx基因的改变。方法：设计并化学合成针对HBx的3对siRNA分子序列(HBx-siRNA1、HBx-siRNA2、HBx-siRNA3),同时设阴性对照组(转染siRNA阴性对照)。脂质体法瞬时转染L02/HBx细胞,通过RT-PCR和Western Blot检测HBx基因在mRNA和蛋白水平的变化以验证HBx-siRNA的抑制效果；Real-time PCR检测细胞中miR-338-3p的表达,Western Blot检测细胞中CyclinD1表达的变化。结果：3对HBx-siRNAs均能降低HBx mRNA的表达,分别降低52.3±2.3%、45.1±3.4%、70.6±4.3%,与阴性对照组相比,差异有显著性(P均<0.01)；3对特异性HBx-siRNAs转染L02/HBx细胞后,与阴性对照组相比,均能抑制]HBx白表达,抑制率分别为54.6±1.8%,45.8士2.2%,78±3.5%(P均<0.01)。转染HBx-siRNA到L02/HBx细胞后,以U6作为内参,Real-time PCR显示细胞中miR-338-3p表达上调(P=0.013)；而Western Blot结果显示CyclinD1的表达水平则显著下降(P<0.001)。结论：干扰HBx基因表达后LO2/HBx细胞中miR-338-3p表达上调,而CyclinD1表达则下降,进一步验证了miR-338-3p与CyclinD1在细胞中的表达依赖于HBx基因的改变,也证实了miR-338-3p直接受HBx基因的影响,通路HBx/miR-338-3p/CyclinD1参与了HBx介导的HCC肿瘤形成的过程。第五章肝癌组织中miR-338-3p、HBx及CyclinD1的表达及相互间关系目的：体外实验已证实并建立了]HBx/miR-338-3p/CyclinD1通路,本部分研究肝癌病人的癌组织与癌旁组织miR-338-3p、HBx及CyclinD1的表达情况,结合临床探讨miR-338-3p在HBx介导细胞增殖方面的作用。方法：收集23例肝癌病人癌组织及癌旁组织,采用qRT-PCR检测23例肝癌病人miR-338-3p的表达,RT-PCR、Western Blot、免疫组化分别检测HBx mRNA、CyclinD1及HBx蛋白表达情况,根据Pearson’s相关性分析研究HBx、miR-338-3p及CyclinD1三者的关系；同时行HE染色,评估肝组织的病理学改变。结果：(1)17例癌组织(17/23,74%)及5例相应的癌旁组织可检测到HBx mRNA表达,miR-338-3p的表达与肝癌分化程度相关,且在癌组织中的表达量明显低于癌旁组织,然而这种差异只表现在HBx阳性的癌组织中p<0.001)；尽管无统计学差异,miR-338-3p在HBx阴性的癌组织中表达略高于癌旁组织(p>0.05)。(2)肝癌组织中HBx蛋白的总体阳性检出率为19/23(82.6%),其中5例相应的癌旁组织检测到HBx蛋白弱表达,miR-338-3p与HBx的表达呈负相关,即HBx积分越高者miR-338-3p的mRNA表达越低。(3)与癌旁组织相比,肝癌组织中CyclinD1蛋白表达明显增强,HBx可上调CyclinD1的表达,且CyclinD1与miR-338-3p的表达呈显著负相关,miR-338-3p表达越高者,CyclinD1表达则越低。结论：①miR-338-3p在肝癌组织中表达下调,然而仅在HBx表达阳性的癌组织中下调,而在HBx表达阴性的癌组织中表达略有上调,但无统计学意义。②miR-338-3p与HBx表达呈显著的负相关。③HBx可上调肝癌组织中CyclinD1的表达,且CyclinD1蛋白表达水平与miR-338-3p呈负相关。