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日本囊对虾是我国对虾养殖的重要品种之一。然而对虾容易受到各种病毒和细菌的侵染而大规模死亡,使对虾养殖业遭受巨大损失。对虾属于无脊椎动物甲壳类,主要依靠先天性免疫对抗自然界的各种病原体。因此研究对虾的先天性免疫能够为防治对虾疾病提供理论依据和指导。 阳离子依赖的6-磷酸甘露糖受体CD-MPR(cation-dependent mannose-6-phosphate receptor)是一种Ⅰ型跨膜糖蛋白,主要分布在反面高尔基体网(TGN,trans-Golgi network)以及质膜(plasma membrane)上。CD-MPR能够特异性识别并且结合含有6-磷酸甘露糖残基(M6P)的蛋白,在高等真核生物中的功能是引导位于TGN上的新合成的溶酶体酶进入溶酶体,因此CD-MPR在溶酶体形成过程中起重要作用。另外,存在于质膜上的CD-MPR能够将细胞外含有M6P的配体捕获运进细胞中。但对于CD-MPR在免疫中的作用有待于进一步的研究。本研究选取日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)作为实验材料,研究了CD-MPR在白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)以及鳗弧菌(Vibrio anguillarum)入侵对虾时所发挥的作用。 1.CD-MPR是WSSV入侵宿主细胞的受体并参与病毒的胞内转运 我们在日本囊对虾中鉴定出一种阳离子依赖的6-磷酸甘露糖受体,命名为MjCD-MPR。MjCD-MPR在血细胞和心、肝、鳃、胃、肠五种组织中均有分布。WSSV侵染对虾后,MjCD-MPR在不同时间点呈现出上调表达。RNA干扰敲降MjCD-MPR表达后,WSSV的极早期基因iel(immediate-early gene1)和囊膜蛋白vp28(envelope protein of WSSV)表达量下降。利用MjCD-MPR抗体封闭质膜上的MjCD-MPR后感染WSSV,发现WSSV的ie1和vp28的表达量下降。MjCD-MPR的胞外结构域蛋白能与WSSV的囊膜蛋白VP19,VP24,VP26蛋白相互作用。上述结果说明WSSV可以通过与MjCD-MPR结合而进入宿主细胞。利用注射MjCD-MPR重组蛋白的方式过表达MjCD-MPR后,再感染WSSV,发现WSSV的ie1和vp28的表达量上升,对虾的成活率明显下降。利用免疫细胞化学的方法观察发现MjCD-MPR在WSSV感染早期向细胞膜移动,感染后期又分散到细胞质,并且在WSSV感染的早期和晚期均能发现MjCD-MPR与WSSV病毒粒子的共定位。上述结果表明,WSSV能够利用MjCD-MPR作为受体进入宿主细胞,并且利用胞质内的MjCD-MPR在宿主细胞中运输。该研究首次发现了一种分子在病毒感染中行使双重功能:既可以作为病毒受体,又参与病毒在胞内的转运。 2.CD-MPR通过促进抗菌肽的表达参与日本囊对虾的抗细菌免疫 对虾受到鳗弧菌的刺激后,MjCD-MPR在不同时间点呈现出明显的上调表达。利用RNA干扰敲降MjCD-MPR在对虾体内的表达后,再感染鳗弧菌,在对虾血淋巴中的鳗弧菌数目显著上升。MjCD-MPR的胞外结构域能够与四种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌)和四种革兰氏阴性菌(大肠杆菌、鳗弧菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌)结合,并且结合脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)和肽聚糖(peptidoglycan,PG)。利用RNA干扰敲降MjCD-MPR后,对虾体内多种抗菌肽的表达量显著下降。这些数据表明MjCD-MPR可能是细菌进入细胞的受体之一,MjCD-MPR随细菌内吞入胞后,会激活下游信号通路,促进多种抗菌肽的表达,起到抑菌的作用。因此,本研究首次发现MjCD-MPR可以作为识别病原感染的模式识别受体,参与对虾的抗细菌免疫。