论文部分内容阅读
鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV),又称鸭瘟病毒(duck plague virus, DPV),是一种导致鸭高传染性、高死亡率的α-疱疹病毒。microRNA(miRNA)为内源性的非编码单链小RNA分子,长度约22个核苷酸,通过与靶基因1nRNA相互作用调节基因的表达,在调节病毒生活周期、促细胞存活、免疫逃避和肿瘤发生等方面发挥重要作用。鸭肠炎病毒编码成熟的miRNAs,但对其调控机制我们却未见报道。本文利用生物信息学方法预测了鸭肠炎病毒编码的33个niRNAs靶基因,并对dev-miR-D13-5p部分靶基因进行了验证及其对病毒增殖的影响进行了探讨,结果报道如下：1. DEV miRNAs靶基因的预测通过生物信息学软件RNAhybrid、miRanda和Targetscan预测33个DEV miRNAs的靶基因,得到其可能潜在调节40多个DEV基因和900多个宿主基因。利用Cytoscape软件绘制DEV miRNAs和宿主mRNA的互作网络。为了更进一步探索DEV miRNAs的功能,Ensemble数据库下载宿主靶基因的GO (Gene Ontology)注释,WEGO生成宿主靶基因GO分类注释图,GO分析揭示902个宿主靶基因映射到42个GO分类,包括11个细胞组分、10个分子功能和21个生物学过程；另外,DAVID分析宿主靶基因的KEGG通路,902个宿主基因只有一小部分富集于11个信号通路,其中MAPK信号通路富集基因最多。2. dev-miR-D13-5p靶基因的验证为了探究DEV miRNA对病毒增殖的影响,选择与病毒复制靶基因UL8(ORF)和UL9 3’UTR紧密相关的dev-miR-D13-5p为研究对象。本研究首先成功构建dev-miR-D13-5p靶基因双荧光素酶报告基因野生型载体pmirGLO-UL8(wt)和突变型载体pmirGLO-UL8(mut),然后dev-miR-D13-5p mimic、NC mimic分别与靶基因野生型和突变型载体共转染COS7细胞,48 h后检测萤火虫荧光素酶活性与海肾荧光素酶活性,并计算两者荧光素酶活性的比值,结果野生型试验组(0.3076±0.0289)和对照组(0.4753±0.0497)相比,差异极显著(P<0.01)；突变型试验组(0.4119±0.0147)和对照组(0.4582±0.0435)相比,差异不显著(P>0.05)；野生型试验组(0.3076±0.0289)和突变型试验组(0.4119±0.0147)相比,差异极显著(P<0.01)。表明dev-miR-D13-5p能与UL8(ORF)或UL93’UTR相互作用。3. dev-miR-D13-5p对靶基因转录水平和病毒增殖的影响构建dev-miR-D13-5p靶基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-UL8(ORF)和pcDNA3.1(+)-UL9(ORF+3’UTR),分别将dev-miR-D13-5p mimic、NC mimic与pcDNA3.1 (+)-UL8(ORF)和pcDNA3.1(+)-UL9(ORF+3’UTR)共转染COS7细胞,48 h后分别进行荧光定量PCR检测UL8.UL9基因的水平,探讨dev-miR-D13-5p mimic对靶基因转录水平的影响。结果显示,与NC mimic组相比,dev-miR-D13-5p mimic组UL8 mRNA的表达量下调79.91%,方差分析差异极显著(P<0.01); dev-miR-D13-5p mimic 组 UL9 mRNA的表达量几乎无变化,方差分析差异不显著(P>0.05)。据此表明dev-miR-D13-5p能抑制UL8mRNA水平,但对UL9mRNA水平影响不显著。为探究dev-miR-D13-5p对病毒增殖的影响,将鸭胚成纤维细胞(DEF, duck embryo fibroblast)接种至24孔培养板中,一段时间后转染dev-miR-D13-5p mimic、 NC mimic,转染12h后感染DEV,并于感染DEV后24 h、48 h及72 h后收集细胞病毒液,绝对荧光定量法检测DEV DNA的拷贝数。结果显示,24 h和48 h时dev-miR-D13-5p mimic组(24 h,5.19×104copies/μl; 48h,1.54×105 copies/μl)与NC mimic 组 (24 h,4.8×104copies/μl; 48h,2.28×105copies/μl)相比,差异均不显著(P>0.05)；72h时,dev-miR-D13-5p mimic组(5.86×105copies/μl)显著低于(P<0.05) NC mimic组(2.57×106copies/μl),表明dev-miR-D13-5p能抑制DEV的增殖。