纤维素是由β-1，4-葡萄糖苷键连接而成的多糖。它们与木聚糖等多糖一起大概占到了植物细胞壁干重的四分之一。每年地球上的光合作用大概固定了4×1010吨的这种多糖。随着地球上化石燃料的枯竭，人们开始注意到这种可持续利用的有机物。尽管纤维素能通过多种途径得到利用，但是人们发现通过微生物的产生的纤维素酶将其水解，不仅效率高，而且对环境的破坏小。但是遗憾的是，利用酶处理原材料的成本较大，所以离广泛应用还存在一定的距离。目前人们普遍通过优化对木质纤维素原材料的预处理过程增加酶的水解效率，或通过分子改造技术来提高酶的催化效率来解决这一问题。　　 双歧菌属的一株放线菌Thermobifida fusca YX已经成为了研究需氧型降解纤维素质的模式菌株。2008年本课题组从云南盐矿分离到同属的一株高温耐盐双歧菌属新种Thermobifida halotolerans YIM90462T。2009年又从该菌的天然菌株中纯化到了一个纤维素酶和一个木聚糖酶，酶学性质研究表明这两个酶均具有较好的热稳定性。本研究以T.halotolerans YIM90462T为研究材料，利用简并引物PCR和染色体步移法从该菌基因组中直接克隆到了一个第9家族的纤维素酶(ThCel9A)基因。接着，在大肠杆菌中对克隆到的这个纤维素酶进行了异源表达、亲和纯化和酶学性质研究。随后，通过基因亚克隆技术将ThCel9A的片段逐个克隆，然后进行连接，从而构建出含有与野生型FnⅢ数量不同的突变体，以分析FnⅢ结构域对纤维素酶酶活的影响。此外，本研究还分别用一个第11家族和一个第6家族的糖苷水解酶催化结构域替换了ThCel9A中的两个FnⅢ结构域，最终构建了两个具有新酶学特性的重组酶。　　 本研究的主要实验结果有:　　 1.第9家族的纤维素酶(ThCel9A)基因的克隆表达及其酶学性质研究。　　 将克隆到的ThCel9A基因序列进行分析表明，ThCel9A由2895个碱基组成，一共编码964个氨基酸残基。成熟蛋白全长916个氨基酸残基，分子量为98.9 kD，等电点为4.06。ThCel9A由4种结构域组成:一个第9家族耱苷水解酶催化结构域，一个第3家族的纤维素结合模块，两个Ⅲ型纤连蛋白结构域和一个第2家族的纤维素结合模块。　　 通过对异源表达的ThCel9A纤维素酶学性质研究表明，ThCel9A既有内切葡聚糖苷酶活性又有一定的外切葡聚糖苷酶活性。该酶的最适反应温度为55℃，最适催化pH为8.0，最适底物为大麦葡聚糖，金属离子Ca2+和Co2+对酶活有促进作用，Mg2+和Zn2+离子对酶活有抑制作用，DTT对酶有促进作用，EDTA对酶有抑制作用，米氏常数Km为12.02 mg/mL，最大催化速率Vm为105.26μM/min。　　 2.ThCel9A中FnⅢ结构域对酶活影响的研究。　　 本研究对ThCel9A中的FnⅢ结构域进行删除/插入后，测定了突变体的最适反应温度和最适反应pH并与野生型的进行了对比。研究结果表明，从ThCel9A中删除一个FnⅢ结构后，尽管突变型酶的最适反应温度和最适反应pH值没有改变，但是酶活与野生型相比在最适温度下下降了35％，在最适反应pH值下与野生型相比下降了43％;如果从ThCel9A中插入一个FnⅢ结构则会使酶完全丧失活性。　　 3.ThCel9A-ThXyn11A双功能酶的构建。　　 为了使纤维素酶获得新的水解特性，本研究用一个第11家族的糖苷水解酶催化结构域替换了ThCel9A中两个FnⅢ结构域。结果发现，重组酶在相同的最适温度和最适pH值下不仅分别能保持原纤维素酶80％和70％左右的酶活，而且还获得了木聚糖酶活性，且其活性略高于相应木聚糖酶。　　 4.通过增加催化域数量来提高酶活。　　 为了使纤维素酶获得更强的水解特性，本研究用一个第6家族的糖苷水解酶催化结构域替换ThCel9A中两个FnⅢ结构域。结果发现，重组酶不仅能保持原纤维素酶的最适温度和最适pH值，而且在最适条件下其活性要明显高于原始纤维素酶。　　 本论文的主要创新点有:　　 1.首次从T.halotolerans YIM90462T新种中克隆到了一个第9家族的纤维素酶(ThCel9A)基因并对其进行了异源表达、酶学性质的研究。这不但丰富了纤维素酶的基因资源，还为改造该菌中的ThCel9A纤维素酶提供了遗传背景。　　 2.本研究对FnⅢ结构域对ThCel9A纤维素酶酶活的影响进行了初步研究。不但为进一步研究FnⅢ结构域对酶活的影响奠定了基础，而且还为揭示FnⅢ结构域的生物学功能提供了新的证据。　　 3.本研究用一个第11家族的糖苷水解酶催化结构域替换ThCel9A中两个FnⅢ结构域，最后获得了一个同时具有木聚糖酶酶活和纤维素酶酶活的双功能酶。这不仅为工业应用提供了新的选择，而且为以后纤维素酶的分子改造提供了新的思路。　　 4.本研究利用一个第6家族的糖苷水解酶催化结构域替换ThCel9A中两个FnⅢ结构域，最后获得了一个比原始纤维素酶活性更高的的重组酶。这为以后纤维素酶的定向改造提供了新的策略。