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日本乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）,属黄病毒科黄病毒属的成员之一,引起的乙型脑炎是重要的人畜共患传染病及虫媒病毒病。由于病毒严格细胞寄生,病毒入侵、复制和组装及释放等的动态过程都依赖于许多宿主蛋白与病原体的相互作用。但是关于JEV NS3靶向的宿主蛋白及这些宿主蛋白对病毒增殖的影响的研究还很有限。本团队先前通过酵母双杂交技术筛选得到了与JEV NS3蛋白相互作用的宿主蛋白DNAJB6,在此基础上,本研究旨在揭示热休克蛋白DNAJB6在病毒增殖中的作用,将有助于阐明JEV的致病机制,并有可能为抗病毒治疗开辟新的途径。本研究首先确证了热休克蛋白DNAJB6与JEV NS3蛋白存在相互作用,并探究了JEV感染对细胞内DNAJB6基因转录和蛋白表达的影响,其次,通过对DNAJB6蛋白进行过表达、敲除以及回补,深入探究DNAJB6蛋白影响JEV增殖的阶段,最后进一步探究DNAJB6蛋白在调控Ⅰ型干扰素信号通路中的作用,并阐明了部分机制。具体工作如下:1.热休克蛋白DNAJB6与JEV NS3蛋白互作确证及相互影响探究本研究成功制备了效价高,特异性好的JEV NS3多克隆抗体。然后应用免疫共沉淀技术确证了热休克蛋白DNAJB6与NS3蛋白存在相互作用,并应用免疫荧光共定位技术证明了DNAJB6蛋白与JEV NS3蛋白在细胞质中的共定位。接下来进一步探究了DNAJB6基因转录水平和蛋白表达水平在JEV感染下的变化情况,应用RT-q PCR检测DNAJB6基因的转录水平,Western blot检测内源性DNAJB6蛋白的表达水平,结果表明JEV感染会导致DNAJB6基因的转录增强,在感染后72h,JEV E基因m RNA水平达到未感染细胞的6倍,但DNAJB6蛋白表达水平随感染时间逐渐降低,且呈现病毒载量依赖的模式,感染复数越大,DNAJB6蛋白表达下降的越明显,但是HEK293细胞单独表达NS3蛋白则并不会导致DNAJB6蛋白的表达水平发生明显的变化。2.热休克蛋白DNAJB6抑制JEV增殖的研究本研究应用CRISPR-Cas9技术成功构建了敲除DNAJB6基因的HEK293细胞,获得了完全丧失DNAJB6蛋白表达能力的HEK293ΔDNAJB6单克隆细胞系。通过对DNAJB6蛋白进行过表达、敲除以及回补,分别用Western blot检测JEV NS3蛋白的表达水平,用RT-q PCR检测JEV m RNA的转录水平以及用蚀斑实验检测JEV的病毒滴度,结果显示过表达DNAJB6蛋白抑制了HEK293细胞中JEV的增殖,NS3蛋白水平极显著降低（P＜0.001）,约为对照组的1/4,病毒m RNA水平在感染后24h约为对照组的1/2,具有统计学差异（P＜0.05）,病毒滴度与对照组相比也显著降低（P＜0.01）;而敲除DNAJB6蛋白则显著促进了JEV在细胞内的增殖（P＜0.01）,NS3蛋白表达水平、病毒m RNA水平和病毒滴度均提高了2倍以上;在敲除细胞中重新回补DNAJB6b蛋白的表达会抑制NS3蛋白表达水平和病毒滴度,但仅能部分恢复对病毒增殖的抑制作用。病毒吸附实验、病毒内化实验均表明敲除DNAJB6蛋白,吸附和内吞进入细胞的JEV的m RNA水平无变化（P＞0.05）,而DNAJB6蛋白功能的丧失导致了敲除细胞内病毒复制极显著增加（P＜0.001）,不同时间点复制子的NS3表达水平均提高了3～5倍,表明DNAJB6蛋白抑制了JEV增殖的复制阶段,但不影响病毒入侵宿主细胞。本研究证明热休克蛋白DNAJB6负调控JEV的增殖,并且是在病毒复制阶段发挥抑制作用。3.热休克蛋白DNAJB6调控Ⅰ型干扰素产生的分子机制研究研究发现热休克蛋白DNAJB6的过表达可抑制宿主抗病毒免疫应答,过表达DNAJB6蛋白抑制Poly（I:C）或仙台病毒诱导的IFN-β的产生和信号通路的激活,并抑制干扰素刺激基因ISG-15的转录,过表达DNAJB6蛋白的HEK293细胞,IFN-β产生的量约为对照组的1/2（P＜0.05）;而敲除DNAJB6蛋白可增强宿主抗病毒免疫应答,敲除DNAJB6蛋白的细胞在Poly（I:C）或Se V的诱导下,IFN-β的产生显著升高（P＜0.001）,可达到正常细胞的10倍左右,并且IFN-β和ISG-15的转录也显著增强（P＜0.05）。这一发现揭示了DNAJB6蛋白在调节宿主抗病毒先天免疫应答中的作用,证明DNAJB6蛋白是Ⅰ型干扰素信号通路的负调控因子。在对其作用机制探究的过程中,我们发现DNAJB6蛋白抑制由RLR介导的信号转导引起的IFN-β的产生,DNAJB6蛋白是在MDA5、MAVS、TBK1、IRF3、以及p65等信号分子介导的信号通路中发挥作用的,进一步的研究表明:DNAJB6蛋白作用于TBK1的水平,是在信号由TBK1向IRF3传递的这一过程发挥抑制作用,接着免疫共沉淀技术也验证了热休克蛋白DNAJB6与TBK1蛋白和IRF3蛋白均能相互作用,且敲除DNAJB6蛋白会促进Poly（I:C）诱导的IRF3的磷酸化从而导致信号通路的过度激活。