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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)耐药的产生成为长期治疗慢性乙型肝炎成功与否的主要障碍。目前检测HBV耐药的方法多种多样，但都因存在一些缺陷，其临床应用受到限制，例如灵敏度低、耗时长、成本高等缺点。在本论文中，我们建立了一种可以同时检测HBV拉米夫定(lamivudine, LAM)及阿德福韦(adefovir, ADV)耐药突变株(rtM204V, rtM204I, rtA181T, rtA181V, rtN236T)的多重连接探针-实时荧光PCR(multiplex ligation-dependent probe real-time PCR, MLP-RT-PCR)方法。该方法结合了多重连接探针扩增(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)技术的灵敏、特异、高通量和实时PCR方便快捷、实时检测的特点。通过检测临床116例慢性乙肝患者DNA样本对MLP-RT-PCR方法进行了方法性能评价，其中检测出LAM耐药突变41例(35.3%)，ADV耐药突变17例(14.7%)及两者共同耐药突变5例(4.3%)。检测结果与金标准直接测序方法比较，MLP-RT-PCR检测rtM204V、rtM204I、rtA181T、rtA181V和rtN236T的符合率分别为95.7%(111/116)、98.3%(114/116)、99.1%(115/116)、98.3%(114/116)和99.1%(115/116)。MLP-RT-PCR方法检测低比例突变株的灵敏度比直接测序方法更高，能够检测0.1%以上的rtM204V、rtM204I、rtA181T和rtN236T突变株，1%以上的rtA181V突变株。MLP-RT-PCR发现了4例低比例临床突变株，并进一步被TA克隆测序方法确证。MLP-RT-PCR能够快速、灵敏检测HBV多重耐药突变位点，为临床提供了一种成本低廉、检测快速的乙型肝炎耐药检测方法。