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小单孢菌(Micromonospora)是一类能产生多种抗生素的稀有放线菌。近年来,随着海洋资源开发的不断深入,海洋微生物新药的发现逐年增多,海洋小单孢菌产生的抗生素具有独特的结构和生物活性,已引起世界各国的重视。然而,关于小单孢菌的遗传操作体系,尤其在基因克隆系统方面的研究甚少。质粒pJTU112是从小单孢菌40027菌株中分离得到的具有自主复制、整合和接合转移功能的质粒。本研究对质粒pJTU112进行序列测定,在此基础上,对复制区和接合转移区进行研究。 对质粒pJTU112的全序列进行测定和分析,质粒pJTU112全长13,648bp,G+C含量为74.6％,包含13个ORF,序列分析结果表明,pJTU112.3、pJTU112.4和pJTU112.5与质粒复制功能相关;pJTU112.1、pJTU112.2、pJTU112.12和pJTU112.13与质粒接合转移功能相关;pJTU112.6与质粒pJTU112的位点特异性重组相关;pJTU112.9可能与质粒的抗生素抗性相关。 利用pHZ199、pOJ260等载体构建了一系列质粒pJTU112的衍生质粒,转入消除质粒的小单孢菌LXH20菌株,包含1.4kbBamHIDNA片段的质粒(如:pJTU111,pJTU116和pSCU207)获得硫链丝菌素或阿泊拉霉素抗性接合转移子,并从接合转移子中分离到相应质粒。而不含1.4kbBamHIDNA片段的质粒,未获得相应抗性接合转移子。表明1.4kbBamHIDNA片段为质粒pJTU112复制必需区。质粒pSCU207包含来自于质粒pJTU112的4.7kbSacI-KpnIDNA片段,在小单孢菌LXH20菌株中具有自主复制功能,表明质粒pJTU112复制区初步定位在约4.7kb的SacI-KpnIDNA片段上。 对pJTU112.5编码蛋白的氨基酸序列进行比对分析,发现pJTU112.5与链霉菌(S.ghanaensis)质粒pSG5中的复制蛋白Rep具有57%的同源性,pJTU112.5上游含有正向重复序列和反向重复序列,与质粒pMEA300、pMEA100、pSG5和pSE211的nick位点比较发现,质粒pJTU112在1647bp处存在一个类似的nick位点。 利用pHZ199构建了质粒pJTU112的衍生质粒pSCU213、pSCU214和pSCU215等,通过大肠杆菌与小单孢菌间的接合转移,将重组质粒转入小单孢菌LXH20菌株中,再通过小单孢菌间的接合转移,验证质粒的接合转移功能。 对pJTU112.1、pJTU112.2和pJTU112.12编码的蛋白比对分析,发现pJTU112.1(302aa)与红球菌细胞分裂蛋白FtsK有32%的同源性;pJTU112.2(478aa)与小单孢菌细胞分裂蛋白FtsK/SpolIIE具有69%的同源性,并且pJTU112.2中包含保守的FtsK/SpolIIE结构域,同时pJTU112.2中含有一个保守的氨基酸序列(RAAGI)和一个保守的核酸结合位点GAGKS;pJTU112.12(785aa)与链霉菌(S.avermitilis)MA-4680中主要的质粒转移蛋白有38%的同源性,含有Ftsk_gamma结构域。