【摘 要】
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大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是大豆中两种主要过敏原蛋白,属于热稳定性蛋白,加热后其抗原性不易改变。蛋白质的致敏性与其结构有关,近年来,通过与小分子活性物质作用从而影响蛋白质结构和性质的研究已受到广泛关注。大豆中天然存在的大豆异黄酮,作为一种小分子活性物质,已被发现具有调节Th1/Th2平衡从而缓解食物过敏的作用。目前,多数文献主要围绕小分子物质本身的抗过敏作用,也有少部分研究表明多酚类物质与蛋白结
【基金项目】
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国家自然科学基金项目:大豆异黄酮对大豆主要过敏原蛋白致敏性的影响及作用机制（批准号:31972186）；
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大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是大豆中两种主要过敏原蛋白,属于热稳定性蛋白,加热后其抗原性不易改变。蛋白质的致敏性与其结构有关,近年来,通过与小分子活性物质作用从而影响蛋白质结构和性质的研究已受到广泛关注。大豆中天然存在的大豆异黄酮,作为一种小分子活性物质,已被发现具有调节Th1/Th2平衡从而缓解食物过敏的作用。目前,多数文献主要围绕小分子物质本身的抗过敏作用,也有少部分研究表明多酚类物质与蛋白结合可降低蛋白的致敏性,但迄今为止,尚无大豆异黄酮与大豆中主要过敏原蛋白作用的相关报道。大豆异黄酮能否改变大豆主要过敏原蛋白结构从而影响其致敏性,这一问题仍有待研究。本论文通过不同的光谱手段,考察两种大豆活性异黄酮（Gen、Dai）与两种大豆主要过敏原蛋白（大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白）之间的作用机制;制备不同形式的大豆异黄酮-大豆蛋白复合物,表征复合物的结构及检测它们的特异性IgE结合能力;通过体外模拟婴幼儿、成人的胃肠消化,分析异黄酮-大豆蛋白复合物的消化稳定性及消化产物的潜在致敏性。主要研究方法、结果和结论如下:1、利用荧光猝灭光谱、同步荧光光谱、三维荧光光谱、疏水性荧光光谱、圆二色光谱分析了两种大豆异黄酮与两种大豆蛋白相互作用的猝灭类型、结合位点数、作用力类型以及作用后蛋白的结构变化。结果表明,两种异黄酮对两种蛋白的猝灭为静态猝灭,它们的结合位点数为1,Dai与大豆球蛋白之间的作用力主要是氢键和范德华力,Dai与β-伴大豆球蛋白、Gen与大豆球蛋白和Gen与β-伴大豆球蛋白之间的作用力则以疏水相互作用为主。两种异黄酮使两种大豆蛋白中酪氨酸和色氨酸残基微环境的极性增加;表面疏水性减小;α-螺旋含量降低,无规卷曲比例增加,使蛋白结构更松散。2、两种大豆异黄酮和两种大豆蛋白分别在碱性、中性两种条件下制备成异黄酮-大豆蛋白复合物,采用SDS-PAGE、圆二色光谱、紫外可见光谱、疏水性荧光光谱、激光粒度仪测定复合物的结构,并通过竞争ELISA评估复合物的特异性IgE结合能力。结果显示,碱性复合物比对应的中性复合物的表面疏水性强;相比于对照蛋白组,大豆球蛋白复合物的α-螺旋减少,β-伴大豆球蛋白复合物β-折叠减少;复合物的粒径分布趋向于更大的直径范围;除G-Dai-N,复合物的IgE结合能力都增强。3、体外模拟婴幼儿和成人胃肠消化异黄酮-大豆蛋白复合物,并评估其消化稳定性。结果表明,两种大豆蛋白及其异黄酮复合物的婴幼儿胃肠消化稳定性比成人强;β-伴大豆球蛋白及复合物的β-亚基耐婴幼儿和成人胃消化但不耐肠消化;大豆球蛋白及复合物在婴幼儿和成人胃肠液中的稳定性都较差;对于两种大豆蛋白,中性复合物与未处理蛋白之间的消化稳定性无明显差异,而碱性复合物则比未处理蛋白更耐胃肠消化。4、通过免疫印迹（WB）和ELISA评价异黄酮-大豆蛋白复合物消化产物的潜在致敏性。WB的结果显示,两种蛋白复合物的婴幼儿消化产物和β-伴大豆球蛋白复合物的成人消化产物仍有很强的IgE结合能力,但经过成人胃肠消化后,大豆球蛋白复合物的IgE结合能力已很弱;同时,婴幼儿及成人消化产物中,碱性复合物含有更多可与特异性IgE抗体结合的肽段,而中性复合物与未处理蛋白无明显差异。ELISA结果表明,对于β-伴大豆球蛋白复合物消化产物的IgE结合能力,Dai复合物强于相同条件的Gen复合物,且均强于未处理蛋白;对于大豆球蛋白,复合物与未处理蛋白的婴幼儿消化产物之间IgE结合能力差异不明显,而复合物成人消化产物的IgE结合能力低于未处理蛋白。
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