水牛乳被誉为“奶中之王”,其蛋白种类和人类必需氨基酸种类含量丰富,并且水牛乳抗氧化活性肽的研究重点还停留在制备工艺上,含有抗氧化活性肽的水牛乳制品还没有。为提高水牛乳产品附加值,本文研究开发具有抗氧化活性的水牛乳饮料并研究其中乳清蛋白抗氧化肽的纯化。对前期研究所选中的中性蛋白酶进行固定,比较琼脂、海藻酸钠和壳聚糖等3种载体在其最适条件下固定中性蛋白酶的酶活力回收率,最高为琼脂,其酶活力回收率达到37.80%,而海藻酸钠固定中性蛋白酶的酶活力回收率最高为19.89%,壳聚糖固定化酶活力回收率最高仅为16.74%,得出琼脂为最佳固定化载体,其最优固定化条件为琼脂浓度3%,每克琼脂载体添加160mg中性蛋白酶、最佳固定化时间为4h。通过比较游离酶和固定化酶的相对活力,发现固定化酶的酸碱稳定性、热稳定性、储存稳定性和操作稳定性等理化性质均比游离酶高,且固定化酶循环使用经过10次后,活力保持了原来的50%以上利用前面制备的固定化酶对脱脂水牛乳进行酶解,最佳酶解工艺为pH7.5、温度55℃、加酶量为2000U/g和酶解5h。验证实验表明,在最佳工艺条件下,水解产物的DPPH自由基清除率达到65.24%。然后将酶解液稀释成抗氧化活性肽含量为50ug/mL的母液进行调配,生产抗氧化活性乳饮料,最佳配方为水牛乳：酶解液=3：1,白砂糖3%(w/v),p-环糊精0.3%(w/v),咖啡2%(w/v)。通过使用10000Da和5000Da卷式膜对水牛乳乳清蛋白酶解物进行超滤分级,得到最佳超滤压力为0.20MPa。超滤后得到了3个组分,其中抗氧化活性最高的是分子量小于5000Da的组分,其DPPH自由基清除率达到60.18%。利用DA201-C大孔吸附树脂对分子量小于5000Da的乳清蛋白酶解物组分进行脱盐,得到最优脱盐条件为每100mL样品上样1h,然后用70%乙醇以50ml/h流速洗脱6小时。DA201-C大孔吸附树脂按最优条件对水牛乳乳清蛋白抗氧化活性肽进行脱盐,最终测得脱盐率达到97.33%,多肽回收率达到80.10%。再通过葡聚糖凝胶G-15柱层析对经过脱盐处理的水牛乳乳清蛋白酶解物进行分离,得到最优分离条件为测量波长280nm,上样量为200ug,洗脱流速为4mL/12.5min。葡聚糖凝胶G-15色谱在最优条件下对水牛乳乳清蛋白酶解物脱盐样品进行分离纯化,收集浓缩出现的4个峰,分别测定其DPPH自由基清除率,发现峰F2抗氧化活性最强,峰F1抗氧化活性次之,但其含量较多。最后利用反相高效液相色谱对葡聚糖凝胶G-15色谱分离出的F1和F2进行分离纯化,F1分离得到3个峰,最大的第2个峰纯度达到70.15%； F2得到3个明显峰和4个不明显峰共7个峰,其中最大的第6个峰纯度达到81.45%。