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研究背景现如今我国人民物质生活水平大大提高,继之冠心病却成为威胁我国人民健康的第一大类疾病。随着药物溶栓治疗、冠状动脉内支架植入术及冠状动脉搭桥术等内外科治疗手段的广泛应用,心肌缺血/再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MIRI)日益成为心血管领域研究的热点。MIRI的主要表现形式之一是心律失常,严重者可发生心源性休克危及生命。因此,阐明再灌注心律失常的发生机理并寻求相应的治疗措施,是临床治疗中亟待解决的重要课题。再灌注心律失常的病理机制较复杂,目前的研究认为,能量代谢障碍和心肌缺血/再灌注(myocardial ischemia/reperfusion,MI/R)后产生过多的活性氧簇(reactive oxygen speciecs,ROS)是再灌注损伤发生的主要病理生理基础。机体自身具有ROS清除系统,以锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,Mn SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)为代表的抗氧化酶可有效清除过度生成的ROS。但是研究发现心肌细胞缺血、缺氧时,ROS清除系统特别是Mn SOD和CAT功能降低或丧失。ROS损伤线粒体更加重能量代谢障碍,同时也促使线粒体产生更多的ROS。因此我们推测保护心肌细胞线粒体功能和ROS清除系统中的抗氧化酶是防治再灌注心律失常的可行途径。去乙酰化酶(Sirtuin)蛋白家族是一类依赖烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)发挥作用的组蛋白去乙酰化酶。研究发现Sirtuin 3(Sirt3)可通过其去乙酰化作用参与调控线粒体能量代谢过程中多种重要的酶的活性,增加三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的生成。另外研究还发现,Sirt3可通过去乙酰化作用上调Mn SOD和CAT的基因表达、增加Mn SOD的活性。上述研究提示:Sirt3可通过NAD+依赖的去乙酰化作用,参与调节细胞能量产生、清除ROS等重要生物学过程。据此可以推测:Sirt3功能缺失可能是再灌注心律失常发生过程中的重要环节。本研究采用Sirt3基因敲除(gene knockout,KO)小鼠模型,观察心肌Sirt3对再灌注心律失常的影响,比较分析Sirt3表达降低是否是加重缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)心肌氧化应激从而加重再灌注心律失常的原因,为临床防治再灌注心律失常提供理论依据和参考资料。研究目的1.明确心肌Sirt3在MI/R引发心律失常中的关键作用,重点探讨Sirt3所调控的心肌抗氧化酶系统在此过程中的生物学作用。2.观察Sirt3 KO是否导致小鼠心肌组织Mn SOD和CAT的表达减少及Mn SOD的活性降低,进而增加MI/R时ROS的产生。3.观察NAD+治疗能否提高小鼠心肌Sirt3活性,进而增加心肌Mn SOD活性,抑制ROS的过度生成,最终抑制再灌注心律失常的发生。研究方法1.将成年(3月龄)野生型(wild type,WT)和Sirt3 KO小鼠各24只随机分成4组:对照组(Control);假手术组(Sham);模型组(I/R)和NAD+治疗组(I/R+NR)。I/R+NR组采用腹腔注射NAD+1 mg/(kg.d)处理7天,随后建立小鼠急性MI/R模型。Sham组小鼠开胸后丝线穿过左冠状动脉前降支,但不结扎冠状动脉。2.小鼠MI/R模型制做过程中以针刺电极插于小鼠四肢皮下全程监测标准肢体Ⅱ导联心电图。记录再灌注心律失常的类型及发生时间。对各组小鼠心律失常类型的分析依据Lambeth会议标准,评分参照Fryer的评分方法,计算MI/R30分钟内的心律失常评分。最后,累计各组中各时段的评分,得出分析结果。3.用ROS敏感的荧光探针CM-H2DCFDA标记心肌细胞,荧光显微镜下检测细胞内H2DCFDA荧光强度变化,以荧光强度反映细胞内ROS含量的变化。ROS阳性细胞在整个核区被染成红色。拍照后用图像分析软件Image-Pro Plus 6.0(Media-Cybernetics Inc)计算平均吸光度值。4.采用BCA法测定心肌蛋白浓度,用Western Blot法检测WT组和Sirt3 KO组小鼠心肌Sirt3、Mn SOD、CAT的蛋白表达水平。5.心肌组织Sirt3活性采用比色法定量检测试剂盒测定。Mn SOD活性测定采用Mn SOD活性试剂盒。实验结果1.采用Western Blot检测小鼠心肌Sirt3蛋白表达显示,Sirt3表达于正常心肌组织中。与WT组小鼠相比,Sirt3 KO组小鼠心肌中Sirt3的蛋白表达水平显著降低,表明Sirt3 KO小鼠动物模型符合实验要求。2.建立小鼠MI/R模型并进行心律失常评分结果显示:WT Sham组小鼠基本无心律失常发生,而MI/R可诱发野生型小鼠出现心律失常。但是,Sirt3 KO组小鼠在Sham组即可观察到心律失常,Sirt3 KO组小鼠MI/R后心律失常评分明显高于WT I/R组小鼠。该结果提示,Sirt3 KO导致小鼠再灌注心律失常显著加重。3.检测各组小鼠心肌组织ROS水平结果显示:与Sham组相比,WT I/R组小鼠心肌ROS水平显著增加。但是,Sirt3 KO组小鼠在Sham组即可观察到ROS生成增加。并且,MI/R后Sirt3 KO组小鼠心肌ROS的增加程度明显高于WT I/R组小鼠。该结果与心律失常评分结果相一致,提示Sirt3 KO导致MI/R小鼠心肌ROS生成显著增加。4.采用Western Blot检测各组小鼠心肌中Mn SOD和CAT蛋白表达水平结果显示,与WT组小鼠相比,Sirt3 KO组小鼠心肌中Mn SOD和CAT表达水平显著降低。该结果表明Sirt3 KO可破坏心肌ROS的清除能力。5.检测NAD+治疗后各组小鼠心肌Sirt3酶活性、Mn SOD酶活性,结果显示:与WT I/R组相比,WT I/R+NR小鼠心肌Sirt3酶活性和Mn SOD酶活性明显增加,并且ROS水平显著下降,心律失常评分也明显降低。但是,在Sirt3 KO组,与I/R组相比,I/R+NR组心肌Sirt3酶活性,Mn SOD酶活性、ROS含量及心律失常评分均未见改善。NAD+治疗引起的上述心肌保护作用基本消失。该结果进一步提示小鼠Sirt3 KO可破坏心肌ROS的清除能力。NAD+治疗可增加小鼠心肌Sirt3酶活性和Mn SOD酶活性进而降低MI/R后ROS含量减轻再灌注心律失常的发生。结论:1.Sirt3是重要的内源性心肌保护因子,其表达减少或缺失将导致心肌ROS清除系统被抑制,促使MI/R后ROS水平增加并加重再灌注心律失常。2.给予外源性NAD+治疗可有效提高心肌Sirt3活性,进而改善心肌Mn SOD活性,有效抑制ROS的过度生成,减轻再灌注心律失常的发生。3.Sirt3表达或活性降低可能是加重MI/R过程中氧化应激损伤并促发心律失常的重要机制。