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罗非鱼（Oreochromis niloticus）是我国重要的养殖经济鱼类,自2009年以来,链球菌病持续危害养殖罗非鱼,给罗非鱼产业发展造成巨大的经济损失。链球菌病的防治已成为罗非鱼养殖中的重要问题及难题。疫苗是防治链球菌病的有效手段。无乳链球菌（Streptococcus agalactiae,GBS）是罗非鱼链球病的主要病原菌,具有十个血清型。无乳链球菌表面蛋白作为疫苗候选抗原,具有大多数GBS血清型中保守的抗原靶点,是跨血清保护性疫苗的良好候选者。为高效表达无乳链球菌表面蛋白富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeat protein from group B Streptococcus,LrrG）及无乳链球菌表面免疫原性蛋白（surface immunogenic protein,Sip）,本研究分析并优化了LrrG及Sip蛋白的密码子序列,人工合成优化后的基因,利用原核表达技术进行表达。检测优化后蛋白的表达量及免疫原性。通过复乳化溶剂挥发法将LrrG蛋白及聚乳酸-羟基乙酸共聚物（poly lactic-co-glycolic acid,PLGA）佐剂制备成双荧光微球PLGA-LrrG,通过口服和注射微球免疫罗非鱼,固定时间点取组织,做成冷冻切片后采用荧光显微镜观察PLGA-LrrG微球在罗非鱼体内的组织分布情况。主要研究内容及结果如下:1.无乳链球菌LrrG蛋白的密码子优化、原核表达及免疫原性研究为高效获得可溶性无乳链球菌表面蛋白（LrrG）,根据大肠杆菌密码子偏好性,优化并人工合成LrrG全基因序列,经双酶切后插入至表达载体,并转染至BL21（Plys）感受态细胞中,高效表达了无乳链球菌富含亮氨酸重复序列蛋白（LrrG）。结果表明:PCR扩增得到2286 bp的优化LrrG基因片段,构建的重组质粒p Czn1-LrrG经双酶切获得约4400 bp和2286 bp两条片段,与预期值相符;重组载体的测序结果与优化后的基因碱基序列比对结果完全一致,编码的氨基酸序列未发生突变;SDS-PAGE和Western blot鉴定结果显示,获得了相对分子质量约为108 k D的LrrG重组蛋白,与理论值相符,且优化后LrrG重组蛋白具有GBS抗原反应原性;通过亲和层析纯化LrrG上清蛋白后,发现优化后可溶性LrrG蛋白表达量较优化前提高了2.2～3.8倍;利用优化后的LrrG蛋白免疫罗非鱼后,发现其对罗非鱼抗GBS感染具有61.54%～69.23%的相对免疫保护率。研究表明,按照大肠杆菌密码子优化GBS表面蛋白LrrG,可有效提高其在大肠杆菌中的表达量,且优化后的LrrG重组蛋白仍然具有较好的免疫原性,本研究结果为罗非鱼链球菌病基因工程疫苗的制备和应用提供了科学参考。2.无乳链球菌Sip蛋白的密码子优化、原核表达及免疫原性研究Sip蛋白是罗非鱼抗无乳链球菌病的疫苗抗原开发靶点。为增加重组Sip蛋白的表达量,本文进行了Sip蛋白的密码子优化,并探讨了其优化前后的表达量及免疫原性。针对大肠杆菌（Escherichia coli）的密码子偏好性对Sip基因进行密码子优化,将优化后基因经双酶切后插入到表达载体p Czn1中。将构建的重组质粒p Czn1-Sip转染至大肠杆菌BL21（Plys）感受态细胞中进行原核表达,经过超声波裂解和Ni柱纯化后,获得Sip上清重组蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot方法检测重组蛋白Sip的原核表达效果及特异性。结果显示,PCR扩增得到1299bp的Sip优化基因片段,构建的重组质粒p Czn1-Sip经双酶切获得2条分别约为4400 bp和1299 bp的片段。测序分析显示,优化后Sip基因的碱基序列与预期一致,氨基酸序列则优化前后一致。SDS-PAGE结果显示成功表达相对分子质量约为53 k D的Sip重组蛋白。蛋白免疫印迹显示优化后Sip重组蛋白具有无乳链球菌抗原反应原性。通过BCA检测后发现,优化后Sip蛋白上清表达量约是优化前的4倍。同时,优化后的Sip重组蛋白对罗非鱼抗无乳链球菌感染表现出69.23%～74.35%的相对免疫保护率。这些结果表明,依据表达菌株大肠杆菌密码子偏好性进行优化Sip蛋白,可有效提高其原核表达量,同时优化表达的Sip蛋白仍具有免疫原性。本研究为罗非鱼链球菌病基因工程疫苗的研发和制备提供了基础数据。3.PLGA-LrrG微球的制备及其在罗非鱼体内的组织分布为探讨PLGA-LrrG微球在罗非鱼体内的组织分布规律,本研究利用罗丹明（Rhodamine,Rh）标记纯化后的LrrG蛋白,通过复乳化溶剂蒸发法将罗丹明标记的红色荧光蛋白和异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate isomer,FITC）标记的绿色荧光微球PLGA制备成双荧光标记微球PLGA-LrrG,并将制备好的微球分别通过注射和灌胃两种方式被动进入罗非鱼体内,之后不同时间点取罗非鱼不同组织,通过冷冻切片和荧光显微镜分析,PLGA及LrrG在罗非鱼体内的分布规律。结果表明:微球平均粒径大小为2.46±0.5 um形态为球形。组织分布结果表明,注射和口服15min,1h,2h,6h,16h,24h,48h,72h的罗非鱼的脾、头肾、肝、肠、鳃、脑的组织切片中均可发现双荧光标记的荧光PLGA-LrrG微球,其中注射组中脾的微球最多,口服组中肠的微球最多。表明PLGA-LrrG微球通过注射和口服的方式,微球能在15min时迅速分布于罗非鱼的脾、头肾、肝、肠、鳃、脑,直到72h时,脾、头肾、肝、肠、鳃、脑中还能观察到少量存留的微球。该结果为PLGA类载体蛋白口服疫苗的研发及其免疫机制的解析提供了基础数据。