目的 构建含有靶向乙肝表面抗原(HBsAg)基因的siRNA、乙肝复合多表位抗原基因和hIL-12共质粒表达的新型DNA疫苗,并在HepG2细胞中检测siRNA的效果以及各基因表达。 方法 设计并合成复合多表位HBV抗原基因,将其与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因融合克隆进真核表达载体pVAX1的多克隆位点中,同时将带CMV启动子的完整hIL-12表达单元克隆进载体的BspH Ⅰ位点之间,再设计并合成乙肝siRNA表达单元,将其克隆进载体的Mlu Ⅰ位点之间,得到真核三元共表达重组质粒pVAX1-siHB-HB-EGFP-hILl2。以该重组质粒瞬时转染人肝癌细胞系HepG2,通过EGFP的荧光标记观察多表位抗原的表达,以ELISA测定培养细胞上清中hIL-12的表达,以rtPCR检测siRNA对HBsAg基因的沉默效果。 结果 经酶切鉴定和测序证实共表达siRNA、hIL-12的HBV多表位DNA疫苗构建成功。转染细胞中检测到绿色荧光,证实抗原表达；转染后48 h hIL-12的检出量为1289 pg/mL细胞上清,72 h检出量为1712pg/mL细胞上清；转染后HBsAg表达量明显降低,证实siRNA效果良好。 结论 成功构建乙肝复合多表位抗原基因与siRNA、hIL-12共质粒表达的DNA疫苗,并能在真核细胞中有效表达抗原与hIL-12基因,而且siRNA对HBsAg显示出明显的沉默效果。我们的工作为进一步研究该复合型DNA疫苗抗HBV的治疗效果打下基础。