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目的:宫颈癌（cervical cancer,CC）是目前全球女性第四大最常见癌症和第四大最常见癌症死亡原因,探究宫颈癌的发病机制及潜在的治疗靶点和早期诊断标志物十分必要。宫颈癌的发病原因以人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染为主,其中以高危型HPV16最常见。HPV16编码的HPV16 E6具有转化特性,它通过整合到宿主基因组中诱导肿瘤抑制基因p53的功能抑制,促进宫颈癌发展。微小RNA（micro RNA,miRNA）是重要的肿瘤调节因子,可作为癌基因或抑癌基因影响细胞生物学功能,从而在宫颈癌的发生和发展中发挥作用。miRNA参与HPV感染和宫颈癌中各种表观遗传变化和DNA甲基化过程。宫颈癌中miRNA的异常表达与HPV16感染密切相关,并且靶向干扰HPV16 E6的表达可影响多种miRNA的表达。研究表明,miR-320a在宫颈癌中发挥抑癌作用,其通过靶向抑制FOXM1的表达抑制宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT并诱导细胞凋亡。而miR-320a的表达是否受HPV16 E6调控,目前尚不清楚。miRNA通过与mRNA的3’-非翻译区（untranslated region,UTR）结合,在转录后水平下调其靶基因表达,从而导致其靶基因的翻译抑制或降解。拓扑异构酶Ⅱα（topoisomerase Ⅱα,TOP2A）可以松弛正/负DNA超螺旋来调节DNA拓扑结构,解决DNA转录和复制过程中的染色单体分离和染色体凝聚,是染色体分离和DNA复制所必需,其表达在增殖细胞和癌细胞中显著升高。研究表明,感染HPV16能够增加宫颈细胞TOP2A的表达,但其表达是否受HPV16 E6及其介导的miRNA调节,目前尚不清楚。综上所述,本研究通过分析基因表达综合数据库（gene expression omnibus database,GEO）GSE81137数据集筛选HPV16感染及未感染宫颈癌患者宫颈细胞中差异表达的miRNA,筛选出其中发挥抑癌作用且与宫颈癌预后良好具有相关性的miR-320a。探究HPV16 E6对宫颈癌中miR-320a的表达影响,并验证HPV16E6是否通过miR-320a调节其下游靶基因TOP2A的表达进而在体外和体内影响宫颈癌细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT,为宫颈癌早期诊断及治疗药物的开发提供理论依据。研究方法:本研究第一部分:通过分析GSE81137数据集筛选HPV16感染及未感染宫颈癌患者宫颈细胞中差异表达的miRNA,生物信息学分析miRNA在宫颈癌组织中表达及与宫颈癌患者预后的关系。收集HPV16阳性和阴性宫颈癌组织及细胞,通过q RT-PCR检测miR-320a表达。将miR-320a抑制剂转染敲减HPV16E6的Si Ha细胞或将miR-320a模拟物转染过表达HPV16 E6的C33a细胞,通过q RT-PCR检测细胞miR-320a表达;通过Western blot检测细胞E6蛋白和凋亡相关蛋白表达;通过CCK-8、Edu和平板克隆形成实验检测细胞增殖情况;通过流式细胞术检测细胞凋亡率;通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;通过Western blot和免疫荧光检测细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志蛋白表达。将敲减HPV16 E6的Si Ha细胞或过表达HPV16 E6的C33a细胞皮下注射裸鼠,并给予antagomiR-320a或agomiR-320a,检测肿瘤体积和瘤重;Western blot检测移植瘤HPV16 E6蛋白表达;通过q RT-PCR检测移植瘤miR-320a表达;通过免疫组化检测移植瘤Ki-67表达;通过TUNEL检测移植瘤的细胞凋亡率;通过Western blot检测移植瘤EMT标志蛋白表达。通过生物信息学分析miR-320a下游靶基因,并从GSE6791和GSE9750数据集中筛选宫颈癌组织中上调的基因,通过韦恩分析筛选出三者的共享基因,通过STRING在线分析网站绘制共享基因的PPI图,并通过Cytoscape软件筛选核心基因,通过生物信息学验证核心基因在宫颈癌组织中表达。本研究第二部分:收集HPV16阳性和阴性宫颈癌组织及细胞,通过q RT-PCR和Western blot检测TOP2A基因和蛋白表达情况。生物信息学在线数据库预测TOP2A mRNA与miR-320a的潜在结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验和AGO2-RIP验证TOP2A mRNA与miR-320a结合。Si Ha细胞敲减HPV16 E6或C33a细胞过表达HPV16 E6,q RT-PCR和Western blot检测TOP2A表达。将miR-320a模拟物及抑制剂转染Si Ha和C33a细胞,Western blot检测TOP2A表达。将miR-320a抑制剂转染敲减HPV16 E6的Si Ha细胞或将miR-320a模拟物转染过表达HPV16 E6的C33a细胞,q RT-PCR和Western blot检测TOP2A表达。将敲减HPV16 E6的Si Ha细胞过表达TOP2A或将过表达HPV16 E6的C33a细胞敲减TOP2A,通过q RT-PCR检测细胞miR-320a和TOP2A mRNA表达;通过Western blot检测细胞TOP2A蛋白和凋亡相关蛋白表达;通过CCK-8、Edu和平板克隆形成实验检测细胞增殖情况;通过流式细胞术检测细胞凋亡率;通过Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力;通过Western blot和免疫荧光检测细胞上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）标志蛋白表达。将敲减HPV16 E6且过表达TOP2A的Si Ha细胞或过表达HPV16 E6且敲减TOP2A的C33a细胞皮下注射裸鼠,检测肿瘤体积和瘤重;Western blot检测移植瘤HPV16 E6和TOP2A蛋白表达;通过q RT-PCR检测移植瘤miR-320a和TOP2A mRNA表达;通过免疫组化检测移植瘤Ki-67表达;通过TUNEL检测移植瘤的细胞凋亡率;通过Western blot检测移植瘤EMT标志蛋白表达。结果:本研究第一部分:miR-320家族在感染HPV16宫颈癌患者的宫颈细胞中表达下调,其中家族成员miR-320a在宫颈癌组织中表达下调,并且其高表达与患者生存率高存在相关性。miR-320a在HPV16阳性宫颈癌组织及细胞中均表达下调。抑制miR-320a能够下调敲减HPV16 E6的Si Ha细胞的miR-320a表达,增加细胞Bcl-2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达,降低细胞Bax、cleaved caspase3和E-cadherin蛋白表达,促进细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,抑制细胞凋亡,促进细胞移植瘤肿瘤生长,增加移植瘤Ki-67表达,降低移植瘤TUNEL阳性率,下调移植瘤E-cadherin蛋白表达,上调移植瘤N-cadherin和Vimentin蛋白表达;过表达miR-320a能够上调过表达HPV16 E6的C33a细胞的miR-320a表达,降低细胞Bcl-2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达,增加细胞Bax、cleaved caspase3和Ecadherin蛋白表达,抑制细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,促进细胞凋亡,抑制细胞移植瘤肿瘤生长,降低移植瘤Ki-67表达,增加移植瘤TUNEL阳性率,上调移植瘤E-cadherin蛋白表达,下调移植瘤N-cadherin和Vimentin蛋白表达。在宫颈癌miR-320a靶基因中,上调的核心基因包括细胞周期蛋白A2（cell cyclin A2,CCNA2）、拓扑异构酶Ⅱα（topoisomerase Ⅱα,TOP2A）、驱动蛋白家族成员20A（kinesin family member 20A,KIF20A）、着丝粒蛋白F（centromere Protein F,CENPF）、RAD51相关蛋白1（RAD51-associated protein 1,RAD51AP1）和驱动蛋白家族成员23（kinesin family member 20A,KIF23）,它们在宫颈癌组织中均高表达。本研究第二部分:TOP2A在HPV16阳性宫颈癌组织及细胞中表达上调。TOP2A mRNA上存在miR-320a的潜在结合位点,且证实TOP2A mRNA与miR-320a结合。敲减HPV16 E6降低Si Ha细胞TOP2A表达,过表达HPV16 E6增加C33a细胞TOP2A表达。过表达miR-320a能够下调Si Ha细胞和C33a细胞的TOP2A表达,抑制miR-320a能够上调Si Ha细胞和C33a细胞的TOP2A表达。抑制miR-320a能够上调敲减HPV16 E6的Si Ha细胞TOP2A表达,过表达miR-320a能够下调过表达HPV16 E6的C33a细胞的TOP2A表达。过表达TOP2A能够增加敲减HPV16 E6的Si Ha细胞TOP2A、Bcl-2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达,降低细胞Bax、cleaved caspase3和E-cadherin蛋白表达,促进细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,抑制细胞凋亡,促进细胞移植瘤肿瘤生长,增加移植瘤Ki-67表达,降低移植瘤TUNEL阳性率,下调移植瘤E-cadherin蛋白表达,上调移植瘤Ncadherin和Vimentin蛋白表达;敲减TOP2A能够降低过表达HPV16 E6的C33a细胞细胞TOP2A、Bcl-2、N-cadherin和Vimentin蛋白表达,增加细胞Bax、cleaved caspase3和E-cadherin蛋白表达,抑制细胞增殖、迁移、侵袭和EMT,促进细胞凋亡,抑制细胞移植瘤肿瘤生长,降低移植瘤Ki-67表达,增加移植瘤TUNEL阳性率,上调移植瘤E-cadherin蛋白表达,下调移植瘤N-cadherin和Vimentin蛋白表达。结论:HPV16 E6通过下调miR-320a的表达增加其下游靶基因TOP2A的表达,在体外和体内水平促进宫颈癌细胞增殖、迁移、侵袭和EMT并抑制细胞凋亡。