目的:胰腺癌恶性程度高,预后差,无有效治疗方法,我们应用生物信息学方法识别胰腺癌中预后较差的高代谢亚型,并根据鉴定出来的高危代谢亚型筛选出角蛋白18（Keratin 18,KRT18）为研究靶点。KRT18作为角蛋白家族中一员,在组织完整性中发挥着重要作用,除了角蛋白的共同功能外,KRT18还调节细胞分裂、迁移性、分化和细胞凋亡。最近的研究表明,KRT18在胃癌、肠癌、肝癌等恶性肿瘤的发生发展、转移复发过程中都起到重要的作用。然而KRT18在胰腺癌发生发展中的确切作用尚不清楚。此外根据本研究中的数据挖掘及分析,我们发现了c-Myc通路在代谢相关高危亚型中明显激活,而且c-Myc通路是在癌细胞发生发展中发挥促癌作用最显著和最重要的通路之一,可影响细胞的增殖、细胞周期、凋亡等多种过程。因此我们推测,KRT18有可能通过c-Myc通路对胰腺癌的发生发展产生影响。本研究通过Western blot和免疫组化染色方法检测胰腺癌组织标本中KRT18的表达情况,并分析了KRT18与胰腺癌细胞的增殖、迁移、与侵袭的关系之后,探讨了KRT18促进EMT过程以及c-Myc通路的调控以及在异种移植小鼠模型中KRT18对肿瘤生长的影响。这种对KRT18的重新认识可能有助于建立一种新的治疗方法,以及发现胰腺癌新的肿瘤标志物。研究方法:第一部分:在公用数据库癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）的胰腺癌患者中,利用分子信号数据库中提取的代谢相关基因和一致性聚类的方法识别出代谢状态不同的亚型。利用生存分析和主成分分析等方法鉴别不同亚型之间的差异。随后在单核苷酸变异方面鉴别亚型之间的差异,从而提升亚型的意义。然后使用加权基因共表达网络分析挖掘亚型相关基因。随后进一步在Metascape数据库中应用分子复杂检测算法来进一步挖掘核心基因。基于本研究的代谢亚型,我们又使用高代谢亚型相关的基因开发临床预测模型。使用的算法是一种机器学习中常用的算法选择最小绝对收缩和选择算子。并且我们在训练组、内部验证组以及两个外部验证组中通过生存分析和时间依赖性受试者工作特征曲线检查模型有效性。单因素多因素Cox被用来确定本研究开发的模型的独立预后价值。以CTRP2.0和PRISM数据库的药敏数据为依据,通过岭回归算法将患者的基因表达数据转化为各种药物在患者中的敏感性,从而预测模型识别的高危患者的敏感药物。第二部分:首先从中国医科大学附属盛京医院收集36对未经放化疗的新鲜胰腺癌及癌旁组织样本,通过Western blot实验和免疫组化实验检测本研究中KRT18的表达量。在胰腺正常细胞HPNE和4种胰腺癌细胞As PC-1、Capan-2、PANC-1、SW1990中通过q PCR实验和Western blot实验检测KRT18基因m RNA和蛋白表达水平。为进一步研究KRT18对胰腺癌细胞恶性表型的影响。本研究使用si RNA（si KRT18-1、si KRT18-2、si KRT18-3）分别转染As PC-1细胞和Capan-2细胞。通过q PCR和Western blot实验检测si KRT18-1、si KRT18-2、si KRT18-3在As PC-1细胞和Capan-2细胞中的敲减效率。为了明确KRT18对胰腺癌细胞增殖的影响,我们首先观察在细胞转染了KRT18 sh RNA后的CCK-8实验和克隆形成实验的变化。为了明确KRT18对胰腺癌细胞迁移的影响,我们观察在细胞转染了KRT18 sh RNA后的伤口愈合实验的变化。为了明确KRT18对胰腺癌细胞侵袭的影响,我们观察在细胞转染了KRT18 sh RNA后的Transwell实验的变化。EMT通路是在癌细胞中发挥着促进肿瘤转移作用最显著和最重要的通路之一。为了确认KRT18是否通过调控EMT信号通路的活化影响As PC-1和Capan-2细胞转移。我们通过Western blot检测各组KRT18、E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白、波形蛋白及Snail的蛋白表达水平。由于在第一部分的研究中,我们发现c-Myc通路在高代谢亚型中明显激活,而且c-Myc通路是在癌细胞中发挥着促癌作用最显著和最重要的通路之一。可影响细胞的增殖、细胞周期、凋亡等多种过程。为了进一步确认KRT18是否通过调控c-Myc信号通路的活化影响As PC-1和Capan-2细胞转移。我们通过Western blot检测各组KRT18和c-Myc的蛋白表达水平。最后,为了进一步确定KRT18促进胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移是否通过c-Myc通路介导。我们计划首先过表达KRT18,然后检测c-Myc通路是否激活以及增殖、迁移、侵袭的表型是否被促进,最后通过c-Myc通路抑制剂检查这些被促进的过程是否得到有效回复。通过这样的rescue回复实验,检验c-Myc通路是否可以介导KRT18的功能。为了进一步明确其在胰腺癌细胞中的作用,我们通过构建10只裸鼠胰腺癌移植瘤动物模型,在体内探究KRT18对胰腺癌肿瘤的生长作用。Western blot实验和IHC实验检测不同模型分组组织中KRT18的表达量。结果:第一部分:本研究将TCGA数据库中的胰腺癌患者划分为两个不同代谢状态的亚型,并且高代谢亚型C1具有更差的生存预后以及更高危的单核苷酸变异特征。并且我们发现了两个与C1和C2亚型相关的基因集。鉴于C1亚型的患者具有更差的预后特点,我们在之后的研究主要集中于与该亚型相关的基因,并将它们输入到Metascape数据库中进行分析。利用MCODE算法进一步筛选出关键基因。经过文献检索,我们从这些基因中锁定KRT18作为后续胰腺癌进展研究的靶点。基于C1亚型相关基因,我们又开发了18个基因组成的临床预测模型并验证其有较高的准确性,且模型可以作为独立预测因素。最后,我们针对高危患者预测了的9种有效药物,其中紫杉醇、AZD8330、LY2606368疗效可能最好。第二部分:36对未经放化疗的新鲜胰腺癌及癌旁组织样本,通过Western blot实验和免疫组化实验检测后发现胰腺癌组织中KRT18的表达量明显高于癌旁组织。As PC-1、Capan-2、PANC-1细胞中KRT18蛋白表达水平明显高于正常胰腺细胞HPNE。CCK-8实验中,As PC-1细胞和Capan-2细胞在转染了KRT18 sh RNA后增殖能力明显减弱（方差分析P＜0.001）。克隆形成实验中sh-KRT18组的胰腺癌细胞As PC-1和Capan-2形成克隆的数目明显减少（T检验P＜0.0001）。伤口愈合实验中,与空白对照组和NC组相比,As PC-1细胞和Capan-2细胞在转染了KRT18 sh RNA后迁移能力明显减弱（T检验P＜0.001）。Transwell实验中,与空白对照组和NC组相比,As PC-1细胞和Capan-2细胞在转染了KRT18 sh RNA后侵袭能力明显减弱（T检验P＜0.001）。与空白对照组和NC组相比,sh-KRT18组的KRT18、N-钙粘蛋白、波形蛋白及Snail蛋白表达水平明显降低（T检验P＜0.05）,而E-钙粘蛋白水平明显升高（T检验P＜0.001）。与空白对照组和NC组相比,sh-KRT18组的KRT18和c-Myc蛋白表达水平明显降低（T检验P＜0.0001）。在胰腺癌细胞As PC-1和Capan-2中观察到过表达KRT18可以有效地促进细胞克隆形成的数目,并且c-Myc通路抑制剂可以有效地回复上述现象（T检验P＜0.0001）。过表达KRT18可以有效地促进伤口愈合的速度,并且c-Myc通路抑制剂可以有效地回复上述现象（T检验P＜0.0001）。过表达KRT18可以有效地增加穿过Transwell小室的细胞数目,并且c-Myc通路抑制剂可以有效地回复上述现象（T检验P＜0.0001）。我们还发现sh-KRT18组裸鼠肿瘤体积明显低于NC组（T检P＜0.01）。Western blot实验和IHC实验结果验证了:与NC组相比,sh-KRT18转染组肿瘤组织的KRT18表达水平明显降低（T检验P＜0.0001）。