论文部分内容阅读
百秋李醇(别称广藿香醇)具有明显的抑菌、抗病毒等功效,广泛应用于药品、食品及日用化妆品行业,当今市场需求量与日俱增。百秋李醇是唇形科植物广藿香VPogostemon cahlin (Blanco) Benth]挥发油的主要成分之一,作为指标成分,被历版《中华人民共和国药典》规定用于评价广藿香药材及其挥发油质量。然而百秋李醇在广藿香中含量低限制了它的开发利用,要提高广藿香中百秋李醇的产量,就必须了解其在广藿香生长发育过程中的动态积累规律及生物合成机制,从而实施有效地调控手段。而目前关于百秋李醇动态积累及其分子生物学机制尚缺乏深入研究。为此,本文对广藿香生长发育过程中百秋李醇的动态积累模式及不同组织间的分布规律进行了研究,对控制百秋李醇合成的关键酶基因,即广藿香醇合成酶(PTS)基因进行了克隆,并对PTS基因在广藿香不同生长发育阶段的表达量进行了检测,主要结果如下：(1)广藿香从种植到完全成熟需要8个月,根据植株形态、颜色、生物量及挥发油含量变化,广藿香生长发育可分为4个阶段,前4个月为缓慢生长阶段、第5、6个月为快速生长阶段、第7个月为成熟阶段、第8个月为完熟阶段。广藿香叶、茎、根中挥发油含量变化趋势一致,均随植株的生长逐渐增加,最终趋于稳定,在完全成熟时期达到最大含量；广藿香茎与根挥发油含量差异不显著,但均显著小于叶。(2)本研究采用GC-MS法检测广藿香挥发油中百秋李醇的含量,结果表明广藿香叶挥发油中百秋李醇与茎的积累模式相似,变化趋势均为先降后升,再下降,而根挥发油中百秋李醇含量变化呈一高一低的波浪状,叶和根中百秋李醇在植株种植第210天达到最大含量,茎在第180天达到最大含量；广藿香叶挥发油中百秋李醇的含量最高,平均含量为42.73%,其次是茎,平均含量为36.55%,根挥发油中百秋李醇含量最低,平均含量为24.31%。(3)本研究比较了CTAB法、改良CTAB法、Trizol法、改良Trizol法及异硫氰酸胍-SDS法5种方法对广藿香根、茎、叶及愈伤组织的总RNA提取效果,结果表明：广藿香根总RNA最佳提取方法为改良Trizol法、广藿香茎和愈伤组织最佳提取方法为改良CTAB法、广藿香叶最佳提取方法为Trizol法。(4)本研究从中国广藿香中克隆得到了PTS基因全长cDNA序列,长度为1659bp,编码552个氨基酸,GeneBank登录号为KP694233；与GeneBank中已登录的印度广藿香PTS基因序列AY508730和KF98351相比,分别有53和14个核酸差异,所推导的氨基酸序列与NCBI中已登录的印度广藿香PTS基因氨基酸序列AHL24448和Q49SP3相比,分别有26个和8个氨基酸差异,氨基酸差异率分别为4.7%和1.4%。(5)本研究克隆得到了广藿香18SrRNA、β-actin和GAPDH基因的片段序列,长度分别为440bp、599bp和496bp, GeneBank登录号分别为KP676601、 KP694234和KP676600。并采用qRT-PCR技术检测这3个基因在广藿香不同生长发育阶段的表达稳定性,结果表明：18SrRNA、β-actin和GAPDH基因的表达稳定性排序为18SrRNA>β-actin>GAPDH,18SrRNA最适宜用作广藿香不同生长发育阶段qRT-PCR分析中的内参基因。(6)本研究应用qRT-PCR技术检测PTS基因的表达情况,结果表明：广藿香生长发育过程中百秋李醇的积累和PTS基因表达在植株生长发育中大部分时间段的变化趋势是一致的,少部分时间则没有相关性,尤其是在叶和茎中。成熟广藿香植株的叶中PTS基因表达量明显高于茎和根,茎略高于根,但差异不显著,说明在成熟的广藿香植株中,广藿香醇合成酶在叶中活性最高。