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猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由PRRS病毒(PRRSV)引起的一种严重危害养猪业的重要病毒性传染病,自上世纪80年代末在美国发现以来,已遍及世界各养猪国家,给全球养猪业造成了巨大的经济损失。猪肺泡巨噬细胞(Porcine alveolar macrophage,PAM)是PRRSV感染的主要靶细胞,也是在体外研究PRRSV感染与免疫调节机制的最佳细胞模型。但原代的PAM难以获取,而且从不同品种、不同日龄、不同个体的猪获得的PAM存在很大的差异,不利于PRRSV的基础研究。近年来,国际上多个实验室开发了永生化猪肺泡巨噬细胞系,但由于永生化过程中一些重要基因(如PRRSV的受体)的丢失或突变,仅有少数永生化猪肺泡巨噬细胞系对PRRSV易感。IPAM(Immortalized PAM)是一株对PRRSV高度易感的永生化猪肺泡巨噬细胞系。为了探讨该细胞系是否适合作为PRRSV体外感染和免疫机制研究的细胞模型,本研究首先比较了PRRSV感染IPAM和原代PAM后病毒增殖的动力学差异,发现在感染早期IPAM对PRRSV较原代PAM更易感;为了解释这一现象发生的原因,对PRRSV感染的PAM和IPAM进行了比较转录组学分析。具体研究内容和结果如下:1. PRRSV在PAM和IPAM中的感染动力学分析将PRRSV(WUH3株)以高剂量(10 MOI)分别接种PAM和IPAM,在感染后不同时间(6、9、12、15、18、21、24和36 h)收集细胞裂解液,测定病毒的TCID50,并绘制一步增殖曲线。结果显示,在感染早期(6-15 h),PRRSV在IPAM上的增殖滴度明显高于在PAM中的增殖滴度,尤其在感染后12 h的差异最大。进一步通过间接免疫荧光实验比较了PRRSV在两种细胞上感染早期(6、9、12、15 h)的感染率,结果也证实PRRSV在IPAM中的感染率高于PAM,与TCID50的检测结果一致,说明PRRSV在PAM和IPAM中的感染动力学存在差异,而且在感染早期IPAM比PAM对PRRSV更易感。2. PRRSV感染PAM和IPAM的差异表达分析基于PRRSV在PAM和IPAM上的感染动力学分析结果,选择PRRSV感染12h后的PAM和IPAM进行RNA-Seq分析。以PRRSV ORF7基因序列作为参考序列,利用subread软件对PRRSV的基因组拷贝数进行统计,比较PRRSV在PAM和IPAM中的增殖能力。结果显示,在IPAM中PRRSV的基因组拷贝数约为PAM中的2.5倍,与感染动力学结果相符。进一步对PRRSV感染PAM和IPAM后的差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEG)进行分析,发现与其未感染对照组(PAM、IPAM)相比,PRRSV感染PAM后产生1285个差异表达基因,其中上调基因为812个、下调基因为473个;PRRSV感染IPAM后产生4316个差异表达基因,其中上调基因为2578个、下调基因为1738个。将这两种细胞的差异基因进行主成分分析,发现PRRSV感染对IPAM的基因表达模式影响更大。3. PAM和IPAM对PRRSV感染的免疫应答差异对PRRSV感染PAM和IPAM的差异表达基因进行KEGG富集分析,发现共有差异表达基因优先富集到TNF、MAPK、IL17等免疫相关信号通路,表明两种细胞对PRRSV感染产生了相似的免疫应答。进一步分析了PRRSV感染PAM后与对应的未感染组细胞相比产生的差异表达基因,结果显示PRRSV感染PAM后的差异表达基因优先富集到免疫应答、细胞因子受体、MAPK、TNF等免疫相关信号通路;PRRSV感染IPAM后与对应的未感染组细胞相比产生的差异表达基因优先富集到囊泡转运、脂肪酸代谢、TCA等代谢相关信号通路。上述结果表明,PRRSV感染PAM后引起更强的免疫应答反应,而PRRSV感染IPAM后引起更强的与病毒入侵、病毒增殖有关的细胞生理和代谢变化。4. PRRSV在PAM和IPAM中的感染率和免疫应答差异的潜在原因分析以前的研究证实细胞周期影响PRRSV增殖,PRRSV在G0/M期的增殖水平高于S期。因此,进一步对PRRSV感染PAM和IPAM后细胞周期相关的差异基因进行了分析,发现PRRSV感染IPAM后下调细胞周期的关键调控基因,如BUB3、BUB1B、CDK2、CDC25C、HDAC10、HDAC1和CASP8;而在PRRSV感染的PAM中,这些基因多被上调表达。由此推测,在IPAM中细胞周期相关基因的下调表达可能导致细胞周期停滞在G0/M期,从而促进PRRSV增殖。SLA类分子是猪源MHC分子,在抗原呈递、免疫识别、免疫应答调控等过程中发挥关键作用。因此,对抗原呈递相关的差异表达基因进行分析,发现IPAM的接毒组及未接毒对照组中均未检测到SLA-DOA、SLA-DQB和SLAMF8的表达。同时,SLA-DMA、SLA-DMB、SLA-5在接毒组及未接毒对照组中的表达丰度也均极低;IFI30、PDIA3在IPAM中的表达丰度也显著低于PAM。由此推测,在IPAM中,抗原呈递相关基因的缺失或低丰度表达可能导致PRRSV感染后IPAM的免疫应答水平低于PAM。天然免疫信号通路在病毒感染过程中发挥着重要作用,为了进一步研究PAM和IPAM对PRRSV应答的差异,本研究对差异基因进行了IPA分析,比较PRRSV感染PAM和IPAM后免疫相关信号通路的差异。结果显示Nod-like receptor(NLR)、Toll-like receptor(TLR)、m TOR、AMPK和PI3K-Akt等信号通路在PRRSV感染的两种细胞中激活状态不同,可能导致了PAM和IPAM中PRRSV增殖的差异性。