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研究背景:我国一直是胃癌大国,每年新增胃癌病例近100万,占全球新增胃癌病例的一半左右。临床上,大多数罹患胃癌的患者在初诊时已处于疾病的中晚期阶段,错过了进行手术根治性切除肿瘤的机会,因此目前化疗仍是晚期胃癌的主要的治疗手段。顺铂是最常用的化疗药物之一,可以治疗包括胃癌,卵巢癌,头颈癌,肺癌和乳腺癌等多种实体肿瘤。但临床上患者往往在接受几个周期化疗后产生耐药,导致治疗效果大大减低。因此探寻新的可提高化疗敏感性的方法十分必要。目前胃癌中预后最好是HER2阳性的转移性胃癌患者,与单独化疗相比,靶向HER2的曲妥珠单抗与化疗的联合使用可以显著提高患者的总生存期(OS)[1],但HER2阳性的患者仅占所有胃癌患者的7-34%[2,3]。所以对于大多数HER2阴性的晚期胃癌患者,依然是主要采用传统化疗的方法进行治疗,但疗效往往受到耐药的限制,因此我们需要进一步寻找新的治疗靶点,看靶向治疗与化疗联合后是否可以逆转耐药现象进而提高对晚期胃癌患者的疗效。既往有大量研究证实c-Met在包括胃癌在内的多种肿瘤中过表达,并且在胃癌细胞的增殖、侵袭和转移中充当致癌作用的“驱动器”,导致胃癌的不良预后,因此c-Met被认为是治疗胃癌的关键靶标[4-6]。小干扰RNA(siRNA)作为一种新方法,在治疗由致病基因引起的疾病方面具有巨大潜力,而外泌体则是输送各种生物活性物质进行治疗的一种高效的、低毒性的、低免疫原性的新型载体,其在循环中具有高稳定性,半衰期长的特点。因此,通过外泌体运载c-Met的小干扰RNA来降低胃癌细胞中c-Met的表达水平可能是增加肿瘤细胞对化疗的敏感性、逆转难治性胃癌患者对顺铂的耐药现象的有前景的治疗手段。研究目的:这项研究旨在确定包裹si-c-Met的外泌体可以降低胃癌中c-Met的表达水平,进而与传统化疗药物顺铂联合使用于耐药性胃癌中,逆转胃癌对顺铂的耐药现象,提高胃癌患者的治疗效果。研究的内容和研究方法:1.临床水平上的研究:(1)通过在Kaplan-Meier plotter肿瘤患者的生存分析软件对确诊胃癌的患者进行分析,想知道c-Met的表达水平高低对胃癌患者生存预后水平的影响,表明c-Met蛋白表达水平的高低与胃癌患者总生存期长短的相关性;(2)收集我们医院手术切除胃癌患者的的癌组织和该胃癌患者的正常的癌旁组织,分别在蛋白水平和信使RNA水平检测胃癌组织及相应的癌旁正常组织中c-Met的表达情况;2.细胞水平:(1)通过向胃癌敏感细胞株SGC7901和耐药细胞株SGC7901/DDP中转染c-Met的小干扰RNA,通过蛋白免疫印迹和进行实时定量PCR分析,分别检测对胃癌细胞株中c-Met的蛋白和信使RNA表达水平的影响;(2)通过分别向HEK293T细胞中转染c-Met的小干扰RNA(si-c-Met)和对照小干扰RNA(si-NC)并通过多步骤梯度离心法获得包裹si-c-Met的外泌体,将该外泌体与胃癌细胞株共同培养48小时后进行后续一些列细胞功能学实验;3.动物水平:(1)小鼠荷瘤模型的建立:将胃癌耐药细胞系SGC7901/DDP注入裸鼠左腹股沟处的皮下区域,隔天注射包裹si-c-Met的外泌体、含有si-NC的对照外泌体和空载外泌体,每三天腹腔注射顺铂;(2)定期监测不同组别小鼠的瘤体大小变化情况,验证注射包裹si-c-Met的外泌体组的小鼠肿瘤生长速度慢于其他两对照组;(3)手术剥离小鼠的瘤体,通过蛋白免疫印迹和实时定量PCR分析验证不同组别的小鼠瘤体中c-Met的表达水平。研究结果:1.临床水平:通过Kaplan-Meier plotter数据库生存分析显示随着随访时间的延长,c-Met高表达的胃癌患者的生存率持续低于c-Met低表达的患者;对临床组织样本进行免疫组化和蛋白免疫印迹实验检测,结果显示胃癌组织中c-Met蛋白表达量明显高于癌旁组织。2.体外水平:为了探讨小干扰RNA对c-Met的抑制作用,将si-c-Met和si-NC转染到胃癌敏感细胞株SGC7901和耐药细胞株SGC7901/DDP细胞中,通过实时定量PCR分析检测c-Met的信使RNA水平并用蛋白免疫印迹验证了c-Met蛋白的表达水平,结果表明si-c-Met可显着降低c-Met的表达水平。根据前期结果,我们在SGC7901和SGC7901/DDP细胞中加入了梯度浓度的顺铂,进行IC50检测,我们发现在浓度为3μg/ml时,顺铂对敏感和耐药细胞株的抑制率差异最显着,因此3 μg/ml是后续实验的最适宜浓度。之后我们用CCK-8试剂盒检测了细胞活力,并计算顺铂对敏感细胞株SGC7901和耐药细胞株SGC7901/DDP的抑制率,通过直接向胃癌敏感细胞株SGC7901和耐药细胞SGC7901/DDP中直接转染c-Met的小干扰RNA24小时后进行CCK8细胞增殖实验检测细胞活度,结果显示si-c-Met可以显著逆转SGC7901/DDP细胞对顺铂的耐药性。提取含有si-c-Met的外泌体,与胃癌敏感和耐药细胞共孵育后发现,该外泌体可以与直接向胃癌细胞内转染si-c-Met得到一致的降低c-Met表达水平的效果。后续进行EDU、Transwell、划痕愈合实验和凋亡实验等一系列细胞功能学实验证实了在顺铂的作用下,加入含有si-c-Met的外泌体可以明显提高胃癌细胞对顺铂的敏感性,明显抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力且促进胃癌细胞的凋亡,且以上作用在耐药细胞株中更加明显,直接证明了外泌体运载的si-c-Met可起到明显逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性的作用。3.体内水平:裸鼠皮下接种SGC7901/DDP细胞进行植瘤建立肿瘤模型,待肿瘤长到长径约8mm时,每隔一天通过尾静脉注射20微克不同的外泌体(悬浮在40微升PBS溶液中)或PBS溶液,每隔3天腹膜内注射5 mg/kg DDP。每两天记录一次肿瘤的长度和短径并计算体积。与两个对照组相比,尾静脉注射包裹si-c-Met外泌体治疗组的肿瘤体积没有明显增加。2周后,手术取出肿瘤并称重,发现注射si-c-Met的外泌体组的瘤体重量明显低于另外两对照组。从各组肿瘤中提取RNA并进行实时定量PCR分析以检测肿瘤中c-Met的mRNA水平。结果表明,注射包裹si-c-Met外泌体治疗组的c-Met mRNA水平明显低于另外两对照组,然后通过蛋白免疫印迹进行验证,exo-si-c-Met组的瘤体中c-Met表达水平同样明显降低。以上结果表明,包裹si-c-Met的外泌体可以明显逆转胃癌对顺铂的耐药性。研究结论:1.胃癌组织中高表达c-Met,且c-Met高表达与胃癌患者的不良预后有相关性;2.si-c-Met可以明显降低SGC7901和SGC7901/DDP细胞中c-Met的表达水平且逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性;3.外泌体包裹的si-c-Met可以与直接转染si-c-Met发挥一样的抑制胃癌细胞中c-Met表达水平的作用;4.在顺铂的作用下,包裹si-c-Met的外泌体可明显抑制胃癌细胞的增殖和迁移能力且促进胃癌细胞的凋亡,可以逆转胃癌细胞对顺铂的耐药性;5.体内实验证实,同样在顺铂处理下,包裹si-c-Met的外泌体可以起到显著抑制小鼠瘤体的生长的作用,逆转胃癌对顺铂的耐药性。