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1.自2003年7月至2004年2月的8个月内收集犬粪样138份,其中家庭单养的腹泻犬粪样52份,犬场群养健康犬粪样81份,腹泻粪样5份。用可鉴定基因型的套式PCR方法检测犬冠状病毒(CCV)。结果显示,81份健康犬粪样中有70份检出Ⅱ型CC,各地的检出率差异不大,南京为80.0%(24/30),沈阳为87.2%(34/39),昆明为100%(12/12)。腹泻病犬CCVⅡ型阳性率南京为40.9%(18/43),上海77.8%(7/9),昆明60%(3/5)。各地均没有检测到典型的Ⅰ型CCV。取各地犬CCV阳性样本PCR产物各2份测序,结果表明,所得Ⅱ型CCV序列都与CCV1-71(96.5-99.5%)及来自中国大熊猫CCV(95.8-99.1%)的M基因序列有很高的同源性,与猪传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)的同源性(93.4-97.2%)高于Ⅰ型猫冠状病毒(FcoV)代表株UCD1(77.8-81.6%)和Ⅱ型FCoV代表株FIPV79-1683(75.9-79.7%)。一个来自昆明的CCV序列在系统进化树上处于Ⅰ和Ⅱ型CCV之间,可能是一个新的变异株。 2.用A72细胞从RT-nPCR检测阳性的腹泻犬粪样中分离CCV,经RT-nPCR和免疫荧光试验鉴定,成功分离到4株CCV野毒,分别命名为CCV KM、NJ2、NJ17、SH3。对CCV KM毒株进行了电镜观察,可见到与CCV参考毒株1-71相似的带“冠”的病毒粒子。细胞适应性试验表明,分离到的野毒在A72细胞上导致的CPE不同于参考毒株的合胞体病变,NJ2、KM株主要导致细胞圆缩、脱落,NJ2株的6-15代在A72细胞上有CPE,但是15代后不再出现CPE。NJ17、SH3在A72细胞上不产生明显的细胞病变(CPE)。参考株CCV1-71及野毒KM、NJ2(8代)都可在A72、MDCK、F81、CrFK等细胞上增殖,只有KM株可在Vero细胞上增殖,并可见明显CPE。交叉保护试验证明,抗KM的血清不能中和其他的CCV毒株,抗CCV1-71的血清可以中和野毒KM、NJ2但是不能中和另外的CCV野毒株HC、DF、HF,说明CCV不同毒株间的交叉保护性很有限。 3.蚀斑克隆纯化CCV1-71株,然后经蔗糖密度梯度离心提纯抗原,免疫BALB/C小鼠,小鼠脾脏与SP2/0细胞融合,用ELISA方法筛选到一株ELISA效价高的杂交瘤细胞株E1,用中和试验方法筛选到两株有中和抗体作用的杂交瘤细胞株N1、N2。ELISA阳性的杂交瘤细胞分泌抗体在细胞培养上清中的效价可达1:2048,小鼠腹水的效价为1:38768,两中和抗体分泌株的细胞培养上清中抗体的效价分别为1:40、1:80,小鼠腹水效价分别为1:20480、1:40960。单抗的特异性检测表明:免疫荧