小鼠iPS细胞的诱导以及白血病抑制因子在细胞重编程过程中的作用机制研究

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第一部分:目的:研究星形胶质细胞重编程为诱导多潜能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞的可行性,为进一步研究iPS细胞诱导技术奠定基础。   方法:用分别含Oct4,Sox2,Klf4和 c-Myc因子的四种逆转录病毒载体病毒颗粒感染星形胶质细胞,获得iPS细胞并进行鉴定。   结果:感染后第28天具有胚胎干(embryonic stem;ES)细胞形态的克隆出现,诱导效率为0.015%±0.0005,且AP染色及SSEA-1和OCT4免疫荧光均显阳性。   结论:星形胶质细胞可以重编程为iPS细胞,进一步证明了iPS细胞诱导技术的普遍适用性。   第二部分:目的:研究microRNA在细胞重编程过程中的作用。   方法:运用miR-294和miR-302a配合单因子Oct4来重编程小鼠神经干细胞,并对所得的诱导多潜能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞进行鉴定。   结果:利用miR-294和miR-302a可将单因子诱导体系的诱导效率提高7倍(0.1%vs0.014%),所得iPS细胞保持未分化状态,AP,SSEA-1和Oct4检测均为阳性。   结论:本实验证实了microRNA在细胞重编程过程中的重要调节作用,探索出了一套安全高效的重编程诱导体系。   第三部分:目的:研究LIF在鼠胚成纤维细胞重编程过程中的作用。   方法:1)选择不同浓度的LIF (0,500,1000,1500and和2000U/ml)配合四因子诱导体系(Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4)来重编程鼠胚成纤维细胞,探索诱导iPS细胞所需的最低外源LIF浓度;   2)采用两阶段诱导法来重编程鼠胚成纤维细胞,病毒感染后0到6天用不含LIF的诱导培养基进行诱导,6天后添加LIF,直到iPS克隆出现并对其进行多能性鉴定;   3)用LIF抗体拮抗靶细胞自身分泌的LIF后,分别用四因子和三因子(Oct4,Sox2和Klf4)来诱导iPS细胞,探索LIF在重编程过程中的可能作用机制。   结果:1)形成iPS克隆所需的LIF最低浓度为1000U/ml,大于此浓度对于iPS克隆的形成并无促进作用;在四因子诱导体系下,LIF对pre-iPS克隆的形成无明显作用。   2)分阶段诱导法可以成功的得到iPS克隆,多能性鉴定显示AP,SSEA-1和Oct4阳性。   3)LIF通过LIF-c-Myc-AP途径来参与重编程,从而激活鼠胚成纤维细胞中AP的表达。   结论:LIF在重编程的第一阶段(从感染后到AP阳性的克隆出现)通过c-Myc来激活靶细胞中内源AP的表达;第二阶段维持pre-iPS克隆和iPS克隆不分化的状态。
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