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第一部分:目的:研究星形胶质细胞重编程为诱导多潜能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞的可行性,为进一步研究iPS细胞诱导技术奠定基础。
方法:用分别含Oct4,Sox2,Klf4和 c-Myc因子的四种逆转录病毒载体病毒颗粒感染星形胶质细胞,获得iPS细胞并进行鉴定。
结果:感染后第28天具有胚胎干(embryonic stem;ES)细胞形态的克隆出现,诱导效率为0.015%±0.0005,且AP染色及SSEA-1和OCT4免疫荧光均显阳性。
结论:星形胶质细胞可以重编程为iPS细胞,进一步证明了iPS细胞诱导技术的普遍适用性。
第二部分:目的:研究microRNA在细胞重编程过程中的作用。
方法:运用miR-294和miR-302a配合单因子Oct4来重编程小鼠神经干细胞,并对所得的诱导多潜能干(induced pluripotent stem,iPS)细胞进行鉴定。
结果:利用miR-294和miR-302a可将单因子诱导体系的诱导效率提高7倍(0.1%vs0.014%),所得iPS细胞保持未分化状态,AP,SSEA-1和Oct4检测均为阳性。
结论:本实验证实了microRNA在细胞重编程过程中的重要调节作用,探索出了一套安全高效的重编程诱导体系。
第三部分:目的:研究LIF在鼠胚成纤维细胞重编程过程中的作用。
方法:1)选择不同浓度的LIF (0,500,1000,1500and和2000U/ml)配合四因子诱导体系(Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4)来重编程鼠胚成纤维细胞,探索诱导iPS细胞所需的最低外源LIF浓度;
2)采用两阶段诱导法来重编程鼠胚成纤维细胞,病毒感染后0到6天用不含LIF的诱导培养基进行诱导,6天后添加LIF,直到iPS克隆出现并对其进行多能性鉴定;
3)用LIF抗体拮抗靶细胞自身分泌的LIF后,分别用四因子和三因子(Oct4,Sox2和Klf4)来诱导iPS细胞,探索LIF在重编程过程中的可能作用机制。
结果:1)形成iPS克隆所需的LIF最低浓度为1000U/ml,大于此浓度对于iPS克隆的形成并无促进作用;在四因子诱导体系下,LIF对pre-iPS克隆的形成无明显作用。
2)分阶段诱导法可以成功的得到iPS克隆,多能性鉴定显示AP,SSEA-1和Oct4阳性。
3)LIF通过LIF-c-Myc-AP途径来参与重编程,从而激活鼠胚成纤维细胞中AP的表达。
结论:LIF在重编程的第一阶段(从感染后到AP阳性的克隆出现)通过c-Myc来激活靶细胞中内源AP的表达;第二阶段维持pre-iPS克隆和iPS克隆不分化的状态。