第一部分乳清蛋白多肽MEIN对小鼠肿瘤抑制作用的研究MEIN是一种具有抗炎功能的营养机能食品,主要成分之一乳清蛋白含有a-乳清蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳铁蛋白等,其经过碱化、超滤、冻干和胰酶分解后形成乳清蛋白多肽。MEIN的另一主要成分为乳酸菌酵解产物,包括用L.bulgaricus和S. thermophilus两种乳酸杆菌发酵脱脂牛奶产生的低分子游离氨基酸、有机酸和短链脂肪酸,更有利于机体吸收。以往研究表明：乳清蛋白对肿瘤具有一定的抑制作用。本研究采用Lewis肺癌和C26结肠癌两种常用的癌症细胞株建立小鼠肿瘤模型,探讨MEIN在体内对肿瘤的抑制作用。肺癌模型中将小鼠分为对照组和MEIN组,每组20只,雌雄各半,分别给予对照饲料AIN-93M和MEIN饲养16天,记录肺癌荷瘤小鼠的进食量、体重、肿瘤重量、肿瘤体积指标,并测定血清中MCP-1、IFN-γ、TNF、IL-12p70、IL-2、IL-4, IL-5、IL-6和IL-10炎症因子水平。肺癌模型结果显示,MEIN组与对照组小鼠体重、进食量均无显著性差异(P>0.05); MEIN组小鼠的平均瘤重与对照组相比有显著性降低(P<0.05)；在肿瘤接种的第8天、第10天、第12天和第16天,MEIN组小鼠的平均瘤体积与对照组相比降低,差异有统计学意义(P<0.05); MEIN的瘤抑制率为51.52%。MEIN组血清中MCP-1和IL-6炎症因子的浓度明显低于对照组,且差异有统计学意义(P<0.05),肺癌模型研究提示：MEIN可能通过降低炎症因子而抑制肺癌肿瘤的生长。结肠癌模型中将小鼠分为四组,每组24只,雌雄各半,分别给予对照饲料、MEIN、环磷酰胺(20mg/kg,隔天腹腔注射)、MEIN+环磷酰胺,连续16天。记录结肠癌模型小鼠的进食量、体重、肿瘤重量、肝脏、肾脏、脾脏和附睾脂肪重量；肿瘤接种一周后,隔天测肿瘤体积。结果显示：四组小鼠的体重和进食量无显著性差异(P>0.05)；MEIN+环磷酰胺组、环磷酰胺组的瘤重与对照组相比降低,差异具有统计学意义(P<0.05)；MEIN+环磷酰胺组、环磷酰胺组小鼠的瘤体积与对照组相比,在第10天、第12天、第14天和第16天有显著性降低(P<0.05)；MEIN组小鼠与对照组相比,其瘤体积仅在第10天和第12天差异有统计学意义(P<0.05)。结肠癌模型中,肿瘤组织病理学检查提示：MEIN组、MEIN+环磷酰胺组和环磷酰胺组小鼠肿瘤浸润性等恶性程度较对照组低。MEIN组肿瘤组织中形成大量的凋亡细胞,未见明显的细胞增殖。MEIN+环磷酰胺组可见散在的空泡细胞、凋亡细胞和凋亡小体。环磷酰胺组空泡细胞变性程度更严重,空泡细胞溶解,凋亡小体和凋亡细胞也较多,并出现核裂解现象。组织病理学发现对照组癌细胞分化程度较低；MEIN组、MEIN+环磷酰胺组、环磷酰胺组癌细胞分化程度较高。MEIN组、MEIN+环磷酰胺组和环磷酰胺组小鼠肿瘤浸润性等恶性程度较对照组低。血清和肿瘤组织中MCP-1、IFN-γ、TNF、IL-12p70、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6和IL-10炎症因子水平的检测结果显示,各组肿瘤组织和血清中炎症因子水平与对照组相比无显著性差异(P>0.05),但MEIN组IL-6和MCP-1水平低于对照组。血常规检查结果显示：对照组的WBC明显高于其他各组,差异具有统计学意义(P<0.05),表明MEIN可能会降低荷瘤小鼠体内的炎症反应。MEIN组RBC高于对照组,且差异具有统计学意义(P<0.05),表明MEIN可能会改善荷瘤小鼠的营养状况。采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血液中IgG、IgA、 IgG、C-反应蛋白(CRP)和ALB的含量。测定结果：IgG和IgM在各组之间差异均无统计学意义(P>0.05)。对照组的CRP高于其他各组,且对照组的CRP与MEIN+环磷酰胺组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),提示：MEIN可能会抑制机体的炎症反应。采用免疫组化TUNEL检测肿瘤切片细胞凋亡结果显示,对照组阳性率为+／-,MEIN组和环磷酰胺组阳性率为++,而MEIN+环磷酰胺组的凋亡率高于其他3组,其阳性率为+++。提示,MEIN和环磷酰胺可以诱导细胞凋亡,且两者具有协同作用。免疫组化方法检钡Ki-67.VEGF与CD34在肿瘤组织中的表达。肿瘤组织中Ki-67检测显示,对照组和环磷酰胺组的染色阳性率为++,MEIN组为+/-,MEIN+环磷酰胺组为+,结果提示,MEIN可以使肿瘤细胞处于静息期,进而抑制肿瘤细胞的繁殖生长。该结果与病理HE染色结果相一致,在对照组肿瘤细胞增生活跃,而MEIN组和MEIN+环磷酰胺组以及环磷酰胺组肿瘤细胞的增殖现象不明显。肿瘤组织中VEGF检测结果显示,对照组阳性率为+++,MEIN+环磷酰胺组和AIN-93M+环磷酰胺为+,而MEIN组中VEGF检出量极低,为+/_。提示,在MEIN或是环磷酰胺的干预下,抑制了肿瘤组织中的新生血管的生成。肿瘤组织中CD34检测显示,对照组阳性率为+++,其他3组为+,结果提示：对照组中肿瘤组织血管生成活跃,而其他3组中虽然检出CD34阳性,但其比例远低于对照组,结果提示,在MEIN或是环磷酰胺的干预下,肿瘤组织中的新生血管生成受到了抑制。本研究运用小鼠肺癌和结肠癌两个肿瘤模型研究MEIN的抗肿瘤作用,结果显示,MEIN对肿瘤的生长具有一定的抑制作用,其作用机制可能通过抑制炎症因子进而抑制肿瘤的生长。第二部分尿激酶型纤溶酶原激活物缺失型小鼠肝纤维化研究我国的肝纤维化和肝硬化的发病率很高,已成为我国一个重要的公共卫生和社会问题。采用uPA基因缺失(uPA-/-)小鼠构建肝纤维化动物模型,与野生型小鼠作为肝纤维化模型比较,其纤维化成功率高,是建立肝纤维化模型的易感品系。本文通过研究uPA基因敲除小鼠(uPA-/-)的生物学特性、病理学较研究和a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)与金属基质蛋白酶-13(MMPl3)的表达,对uPA基因敲除小鼠(uPA-/-)肝纤维化模型的机制进行研究并评价。uPA基因敲除杂合子小鼠从美国Jackson Laboratory引进,经过两年育种培育成纯合子小鼠,小鼠饲养于SPF屏障系统中。温度控制22+1℃,相对湿度为50%-10%,明暗交替12h：12h。定期测定uPA-/-小鼠体重、血液生理生化值以及脏器(心、肝、脾、肺等)的重量,统计其繁殖特性,并对两性的数值进行比较。选取成年雄性BL/6J野生型和uPA-/-基因缺失型小鼠,分为四组：对照组(WT,uPA-/-)和模型组(WT,uPA-/-),每组10只。模型组小鼠腹腔注射10%CC140.15ml,对照组小鼠腹腔注射橄榄油0.15ml,每周2次,连续6周。称取动物体重和肝脏等脏器重量,计算脏器系数；取肝脏做大体病理观察；用HE染色和Masson三色胶原染色观察组织病理学改变；并进行电镜超微结构观察；用real-time PCR方法检测小鼠肝脏组织中a-SMA和MMP13的mRNA表达,western blot及免疫组化分析a-SMA和MMP13的蛋白表达。uPA基因敲除小鼠具的生物学特性研究显示,4-30周龄uPA-/-小鼠体重性别间差异有统计学意义(P<0.05),体重随周龄增加而增长,前期增长快,后期增重慢；uPA-/-小鼠繁殖性能平均产仔数为6.30+1.02只,平均妊娠期为20.5+1.9d,uPA-/-小鼠脏器重量的测定结果显示心脏性别间差异显著(P<0.05)、脾的脏器重量性别间差异极显著(P<0.001),其余脏器重量性别间差异不显著。8周龄uPA基因敲除小鼠血液生理指标中红细胞平均体积(MCV)、血小板平均体积(MPV)、红细胞分布宽度-CV(RDW-CV)、嗜酸性粒细胞绝对值(E0)性别间有显著性差异(P<0.05)；血清生化指标中uPA基因敲除小鼠性别之间谷丙转氨酶ALT、血糖GLU、总胆固醇TC、胆碱脂酶CHE有显著差异(P<0.05),总蛋白TP、白蛋白ALB有极显著差异(P<0.001)。结论：uPA基因敲除小鼠具有自身的生物学特性。uPA基因敲除小鼠病理学研究,与野生模型组小鼠相比,uPA-/-模型组小鼠的肝脏纤维化程度更加严重。表现为肝脏重量和肝脏系数的显著增加(P>0.05)；大体观察肝脏肿大、色灰暗发白、出现颗粒状结节；HE染色、Masson染色和电镜超微结构均提示uPA-/-模型组小鼠肝细胞破坏严重,胶原纤维沉积更广泛,并形成了假小叶。Real-timePCR结果显示uPA-/-小鼠的肝脏中α-SMA.MMP13的mRNA表达量显著高于WT小鼠；western blot结果显示α-SMA蛋白在对照组小鼠肝脏中几乎不表达,在WT模型组中有少量表达,在u.PA-/-模型组中表达明显增多,MMP13蛋白在Mod-WT组肝脏组织中有少量表达,在Mod-uPA-/-组中表达增多；免疫组化结果显示,Mod-uPA-/-的a-SMA和MMP13表达高于Mod-WT。结果提示：uPA-/-模型组的肝脏纤维化程度比WT模型组严重,α-SMA的mRNA和蛋白表达在uPA-/-小鼠中均明显升高,MMP13蛋白表达在肝纤维化模型小鼠中均有明显升高。可能的机制为：uPA基因的缺失促进了肝星型细胞向肌成纤维细胞的转化,从而加速了细胞外基质蛋白在肝脏中的沉积。uPA基因敲除(uPA-/-)小鼠具有自身的生物学特性,部分指标两性间测定值有差异；uPA-/-小鼠是建立肝纤维化模型的易感品系,并且成功率高。从而uPA基因敲除(uPA-/-)小鼠肝纤维化模型的建立有助于阐明纤维化的发病机制,为新药的筛选和药效研究提供了优良的模型,为临床治疗提供理论依据和切入点。