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目的骨髓炎（osteomyelitis）,一种急性或慢性的的骨或骨髓感染性疾病。根据骨髓炎的Cieny-Mader分型,对A型和B型患者可通过多次清创或大段骨切除的手段来达到骨髓炎根治的目标,而C型患者通常仅能行姑息治疗策略,感染不易治愈,具有高复发率,影响患者的生活质量,还可能带来细菌对抗生素的耐药性。临床研究显示骨髓炎的感染复发风险与局部骨量丢失高度关联。感染组织和病灶周围的部分正常组织均在一定程度上受到细菌侵袭,可造成局部骨稳态失衡,导致继发性的骨吸收,引起局部骨量丢失,骨量丢失形成的微死腔可导致细菌生长繁殖,并在内壁形成细菌生物膜（biofilm）,是局部感染复发的重要原因。微观上的死腔最终连接形成宏观的骨缺损、骨不连,造成病人残疾和死亡。根据感染源,骨髓炎可以被分类成几种类型,血管缺乏型（如糖尿病足）,继发感染型（假体植入术,其他手术后或创伤后）,直接注射或血源性播散型。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）作为机会致病菌广泛存在于皮肤和粘膜表面,是包括骨髓炎在内的多种感染性疾病的直接病因,研究表明金葡菌在骨髓炎患者样本中有38%到67%的阳性培养率。TNF-α作为重要的炎症因子参与调节骨稳态,长期以来被认为在骨髓炎的发病机理中扮演重要角色。TNF-α调节骨稳态的机制包括:促进骨吸收,促进破骨细胞分化,增加破骨前体细胞数量和促进破骨细胞功能成熟;抑制骨形成,抑制成骨细胞分化和成骨细胞功能。因此,TNF-α被认为是抑制骨髓炎继发性骨吸收的重要靶点,但是有关TNF-α在骨髓炎发病过程中抑制成骨细胞功能的研究较为有限。一氧化氮合酶（NOS）作为体内一氧化氮（NO）的主要来源有三个亚型,中枢型NOS（nNOS）、诱导型NOS（iNOS）和内皮型NOS（eNOS）,内皮型NOS广泛存在于成骨细胞、骨髓干细胞、破骨细胞和骨细胞中,以钙依赖形式持续产生低浓度的一氧化氮。研究表明一氧化氮作为炎症调节因子在金葡菌引发的关节炎中起保护性作用,更具体的研究显示eNOS通过调节成骨细胞来调节骨稳态和骨量,但影响eNOS表达水平的上游机制仍有待研究。MicroRNAs（miRNAs,miRs）是一群内源性的小非编码性的RNA,典型的有18-25个核苷酸长,通常通过不完全的碱基配对到mRNA的三个主要非转录区（3’-UTR）来抑制基因表达。miRNAs已经被证实可以通过结合在氨基酸编码区来调节目标mRNA的转录。许多miRNAs参与成骨细胞的分化和骨形成过程,如miR-26a、miR-125b、miR-133和miR-135。但是miRNAs在骨髓炎中的作用及机制仍需要进一步研究。因此,在本次研究中,基于TNF-α在调节骨稳态中的作用,我们假设TNF-α在金葡菌引起的骨髓炎中的病理作用涉及到miRNAs。并通过查阅文献和算法预测发现miR-129-5p有可能参与eNOS的转录过程,并经实验验证可被TNF-α所抑制,miR-129-5p可能是连接TNF-α下游调控通路和骨髓炎发病机理中的关键因子。综上所述,本实验拟探索TNF-α能否通过miR-129-5p作用于eNOS,抑制成骨细胞骨形成功能;TNF-α的抑制剂能否通过作用于miR-129-5p调节eNOS表达水平,解除骨形成抑制,进而缓解骨髓炎中的继发性骨吸收。方法临床样本中,通过手术取样和血培养确定是金葡菌引发的骨髓炎患者共30名,作为感染组,另有16名年龄相仿的健康志愿者中取血培养样本作为对照组。细胞实验中,成骨前体细胞系（MC3T3-E1）作为对照组,金葡菌（ATCC 53657）作为感染源与MC3T3-E1共培养作为感染组,之后用20mg/ml的溶葡球菌酶溶解细胞外的金葡菌,更换培养基,制造金葡菌感染成骨细胞的体外模型。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）测定感染组和对照组的TNF-α、过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPAR-α）、细胞间粘附因子2（ICAM2）、生长激素受体（GHR）、促肾上腺皮质激素释放激素受体2（CRH-R2）和eNOS的mRNA水平,确定TNF-α在受感染的MC3T3-E1细胞中的变化,寻找与TNF-α变化有关的下游因子,初步确定下游因子后再在临床样本中检测进行验证。运用miRanda算法选取miR-129-5p作为靶向eNOS的mRNA的miRNA候选者,通过将eNOS的mRNA的3’端序列和对照序列克隆到荧光素酶的开放阅读区的下游,制备具有eNOS的mRNA的3’端序列的荧光素酶;将miR-129-5p和类似物（MC10195）转染到MC3T3-E1细胞内过表达,检测荧光强度,通过荧光素酶标记实验验证miR-129-5p对eNOS的mRNA的3’端序列的靶向性;通过PCR和WB实验检测eNOS的mRNA和蛋白质表达水平,验证miR-129-5p对eNOS的mRNA的靶向抑制。在细胞模型中和临床标本中检测感染组和对照组中miR-129-5p表达水平,确定miR-129-5p表达变化。茜素红染色和碱性磷酸酶染色用来评价MC3T3-E1细胞的成骨能力情况。用miR-129-5p抑制剂（MH10195）和类似物对MC3T3-E1细胞进行转染,观察MC3T3-E1细胞的成骨能力变化;将表达eNOS的质粒和对照质粒转染进MC3T3-E1细胞,观察MC3T3-E1细胞的成骨能力变化;使用TNF-α抑制剂（Adalimumab）干预感染组和对照组的细胞模型,通过qRT-PCR检测miR-129-5p和eNOS的表达变化,观察MC3T3-E1细胞的成骨能力变化。结果在骨髓炎病人血液中和受金葡菌感染的MC3T3-E1细胞中,TNF-α和miR-129-5p的表达提高,而eNOS表达降低,显示出相关的相反的表达趋势。miR-129-5p直接结合在eNOS的mRNA的3’-UTR端,抑制其在MC3T3-E1细胞中的表达。TNF-α抑制剂降低了miR-129-5p的水平并提升了eNOS的表达,改善了受金葡菌感染的MC3T3-E1细胞的成骨能力缺损情况。在金葡菌感染时,表达增多的TNF-α会引起内源性的miR-129-5p的表达,反过来会抑制eNOS,加重骨髓炎的症状。结论实验结果表明一个新颖的信号级联反应参与骨髓炎发病机理,包含TNF-α/miR-129-5p/eNOS,在金葡菌感染期间,提高的TNF-α增加了内源性miR-129-5p的表达,反过来抑制了eNOS,导致成骨细胞的成骨能力缺损,加重感染继发的骨量丢失,使骨髓炎恶化。此外,TNF-α,miR-129-5p和eNOS可作为干预靶点用于骨髓炎的治疗,有临床应用的前景。