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背景：脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一,在我国每年死于脑血管病的患者多于心脏病及癌症,居三大死因之首。缺血性脑血管病是威胁人类的常见病、多发病,因此寻找有效的治疗手段并阐释其机理仍然是目前脑科学领域的研究热点。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)也称为应激活化蛋白激酶(stress activated protein kinase,SAPK),是MAPK家族的重要成员,属于进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是中枢神经系统内主要的信号转导通路之一。JNK信号通路可被细胞因子、生长因子、应激等多种因素激活,参与细胞增殖与分化、细胞形态维持、细胞骨架构建、细胞凋亡等多种生物反应。JNK在细胞应激反应中起重要作用,能被多种细胞外应激信号激活,因而也被称为应激活化蛋白激酶。JNK是位于细胞质的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,含有双磷酸化功能区Thr-Pro-Tyr,因JNK可以结合c-Jun氨基端活化结构域,并磷酸化其第63位和73位丝氨酸残基而被命名为JNK。迄今已发现了由JNK1、JNK2JNK3的不同剪接形式组成的10种同源异型蛋白,JNK1和JNK2的表达具有广泛性,JNK3仅在大脑、心脏和睾丸中表达。目的：本实验是想通过科学方法探索脑缺血/再灌注后脑内MAPK家族信号通路的调控及电针干预作用的影响,从而进一步了解电针治疗对脑缺血/再灌注后脑内MAPK家族信号系统调控机制及细胞凋亡的影响。对“针刺刺激-复合信号调控-良性修养机制启动是其脑缺血/再灌注后治疗的关键作用机制之一”的科学假说加以探讨,对研究电针对脑缺血/再灌注治疗在干预机制有一定的参考意义。方法：选用JNK基因敲除小鼠36只,按随机数字表法随机分为假手术组、模型组和电针组,其中假手术组、模型组和电针组每组又分为2h(小时)、1d(天)、3d(天)三个时间段组,共9小组,每小组4只小鼠。模拟临床脑梗塞的证型,选择以基因敲除小鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery oeelusion,MCAO)为模型,采用临床常用的对脑缺血及其后遗症有确定疗效的针刺和电刺激结合起来的电针治疗局灶性脑缺血。针对MAPK通路在脑缺血中作用途径、作用机制这一关键问题,从多环节、多层次、多靶点上观察电针对MAPK通路的影响及电针对脑缺血后海马神经元的保护作用,电针“尺泽、合谷”和“足三里、三阴交”组穴,从缺血侧皮质及海马CA1区神经元入手,采用神经学分级评定、形态学、光镜、免疫组化与原位杂交、脑片制作及扫描显微镜等技术,观察小鼠脑缺血/再灌注后不同时间段(2h、1d、3d)动物整体行为、病灶侧神经细胞形态和细胞凋亡的动态变化,分别观察与脑缺血/再灌注后ERK、P38MAPK信号通路的变化在累加电针后的表达,分析JNK信号通路与其它两条信号通路的内在联系,从而对电针促进保护脑缺血后海马神经元细胞凋亡和MAPK的作用途径、作用机制进行深入的探讨,为进一步阐明大脑缺血再灌注后损伤细胞保护的可利用途径,为临床更好改善脑缺血后大脑功能的恢复提供更为确切的理论依据。结果：1.电针对脑缺血再灌注(I/R) JNK基因敲除小鼠神经功能缺损评分的影响各组小鼠在造模后各个时间段的行为进行观察并进行评分,所有数据通过spssl3.0统计进行分析,数据呈正态分布,方差齐采用LSD检验法分析。假手术组基因敲除小鼠神经行为学表现均正常,各组评分均为0分。而模型2h组和电针2h组与假手术组进行比较,有显著差异(P<0.01),具有统计学意义,说明脑缺血再灌注的基因敲除小鼠模型是成功的。模型2h组和电针2h组比较,两组差异虽有统计学意义,但是差异并不明显(P<0.05),而在两组的1d和3d组比较,神经行为学评分不但有统计学意义,而且差异显著(P<0.01),说明电针对脑缺血再灌注后神经功能损伤有治疗作用,早期干预就会产生作用,而且会随着治疗时间的延长作用也更加明显。2.电针对脑缺血再灌注(I/R) JNK基因敲除小鼠脑组织大体形态学影响(TTC染色)从TTC染色后摄像所得的脑缺血再灌注组织图像观察分析,并利用相配套的图像信号采集与分析系统进行观察。基因敲除小鼠在造模后模型组和电针组与假手术组比较,大脑组织形态学出现较大改变而且在再灌注早期就出现大面积梗死。模型组的梗死体积最大,而电针组在1d和3d后脑梗死体积较模型组有所减轻。对基因敲除小鼠脑梗体积测算显示,模型组与假手术组差异显著(P<0.01)与电针组对比以3d组较为明显,差异有统计学意义(P<0.01),模型组各时间段比较差异不显著无统计学意义(P>0.05),而电针组不同时间点段比较电针3d组与2h组比较差异较为明显,有统计学意义(P<0.01)。结果表明：第一、基因敲除小鼠缺血再灌注模型造模是成功的；第二、脑缺血再灌注的时间长短和脑组织的损伤影响关系很大；第三、尽早运用电针干预治疗有助于脑缺血再灌注损伤的保护,而治疗时间的长短与保护的效果有关。3.电针对脑缺血再灌注(I/R) JNK基因敲除小鼠脑组织显微形态学影响造模后各组与假手术组观察比较,显微形态学的观察较为直观,各时间段的切片观察脑组织的损伤表现最明显发生在第3天,可见细胞结构及排列有不同程度紊乱。从各组光镜结果可见,假手术组的大脑皮质各层细胞大致正常,细胞排列规则有序,结构完整；电针组可见大脑皮层细胞结构比较完整,排列有序,少数神经细胞固缩坏死：模型组出现大量神经细胞皱缩,变性坏死收缩。4.电针对脑缺血再灌注(I/R) JNK基因敲除小鼠神经细胞凋亡指数的影响对基因敲除小鼠进行造模后,从病理切片上可以看出,模型2h组和电针2h组与假手术2h组比较,出现大量的神经细胞凋亡。模型2h组和电针2h组小鼠凋亡指数与假手术2h组比较明显升高,有显著差异(P<0.01),电针2h组与模型2h组比较,电针组比模型组凋亡指数降低,差异有统计学意义(P<0.05),模型组和电针组在缺血再灌注1d后,细胞凋亡高峰出现,在缺血再灌注3d时,细胞凋亡下降明显,两组3d组和1d组比较有显著差异(P<0.01)。结果表明：模型组、电针组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01),说明脑缺血再灌注后引起了基因敲除小鼠脑神经细胞的凋亡。而电针组与模型组在缺血再灌注1d后细胞凋亡出现高峰,表明细胞凋亡的出现存在一定的时间窗,在细胞凋亡到一定程度及开始下降。电针组与模型组各时间段的对比均有差异,存在统计学意义(P<0.01),表明电针干预作用可以对脑缺血再灌注后神经细胞的凋亡起到有效的保护作用。电针组内各时间段的两两比较,均存在差异,有统计学意义(P<0.01),说明越早进行干预,越能够保护脑缺血后神经细胞的损伤。5.电针对脑缺血再灌注(I/R) JNK基因敲除小鼠P-ERK蛋白表达的影响采用免疫组化检测p-ERK在脑组织中的分部情况。小鼠造模后,大脑缺血侧皮质及海马CA1区p-ERK表达受到一定程度的抑制阳性细胞不多,电针组各时间点较模型组阳性细胞明显增多(P<0.05),1d、3d时间点显著(P<0.01)。结果表明：模型组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01),说明造模后脑缺血区p-ERK的表达受到抑制。电针组与模型组比较,均有差异,存在统计学意义(P<0.05),表明电针治疗后p-ERK的活性明显提高,从而促进因缺血缺氧导致的脑细胞的存活与修复。6.电针对脑缺血再灌注(I/R) JNK基因敲除小鼠P38MAPK蛋白表达的影响采用免疫组化检测P38MAPK在脑组织中的分部情况。小鼠造模后,大脑缺血侧皮质及海马CA1区P38MAPK阳性细胞明显增多,电针组各时间点较模型组阳性细胞明显减少(P<0.05),1d、3d时间点显著(P<0.01)；3d时间点最为明显(P<0.01)。结果表明：模型组与假手术组比较,差异有统计学意义(P<0.01),说明造模导致基因敲除小鼠P38阳性表达上调,电针组与模型组比较,均有差异,存在统计学意义(P<0.05),表明早期电针治疗对脑缺血后P38信号通路起到了抑制作用。电针组内1d组、3d组有显著差异,有统计学意义(P<0.01),说明在脑缺血再灌注损伤有一定的时间窗,说明早期针刺干预,能够保护脑缺血后神经细胞的损伤。结论：1.电针“尺泽、合谷”、“足三里、三阴交”能明显改善JNK基因敲除小鼠脑缺血／再灌注损伤后的神经功能缺损和脑组织形态,并能降低细胞凋亡指数,提示电针“尺泽、合谷”、“足三里、三阴交”对缺血损伤脑组织具有一定的保护作用。2.电针“尺泽、合谷”、“足三里、三阴交”可促进造模后的p-ERK蛋白表达上调,提示ERK信号转导通路的激活是电针“尺泽、合谷”、“足三里、三阴交”促缺血性损伤脑组织修复的重要特征。3.电针“尺泽、合谷”、“足三里、三阴交”可促进造模后P38MAPK蛋白表达下调,提示P38MAPK信号转导通路的抑制是电针“尺泽、合谷”、“足三里、三阴交”促缺血性损伤脑组织修复的重要特征。4.电针“尺泽、合谷”、“足三里、三阴交”对脑缺血再灌注后的神经功能缺损、脑组织形态、细胞凋亡指数的改善以及信号通路的调控均在脑缺血再灌注后3天时间点处较为明显,表明该时间点为促进自身修复的较佳治疗时间窗。5.实验结果提示“针刺刺激-启动MAPK信号调控-拮抗细胞凋亡”,是针刺治疗脑缺血/再灌注后脑损伤关键作用机制之一。本课题创新点：1.首次应用JNK基因敲除小鼠用于脑缺血再灌注研究。2.在脑缺血模型JNK基因敲除小鼠中首次系统的观察了针刺对MAPK信号通路的调节干预作用,为临床治疗脑缺血疾病提供了新的理论依据。