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NK细胞可直接杀伤某些肿瘤和病毒感染细胞,在固有免疫应答中起着关键的作用。树突状细胞(dendritic cells, DC)是激活初始T细胞、启动特异性免疫应答的重要抗原递呈细胞。最近发现一类能够分泌IFN-γ并具有杀伤功能的新型树突状细胞亚群(IFN-γ producing killer dendritic cells, IKDC),该亚群细胞既具有NK细胞的表面标记,又具有常规DC的表面标记,即CD3-CD19-CD11cintB220+NK1.1+CD49b+Gr1-。与NK细胞类似,IKDC表达活化性受体NKG2D介导对靶细胞的杀伤作用；在肿瘤细胞的训化下,IKDC表面MHCⅡ类分子和共刺激分子的表达增强,并能交叉提呈肿瘤抗原给T细胞,从而启动抗肿瘤的适应性免疫应答。因此,在肿瘤的免疫治疗中具有良好的应用前景。但是,IKDC在小鼠体内的含量极少,只占脾脏CDllc+细胞的1-2%(约50000个)和骨髓CDllc+细胞的2%,用直接分选法获得的IKDC数量远远不能满足过继免疫治疗所需的细胞数。本研究试图构建共表达小鼠Rae-1ε (NKG2D的配体)和膜表达型IL-15的转基因细胞株,利用该转基因细胞株给IKDC提供双重活化信号,从而达到体外刺激IKDC增殖和活化的目的。第一部分：BaF3/mb15/RAE转基因细胞株的制备利用重叠PCR技术将小鼠CD8α基因的信号肽序列、小鼠IL-15成熟肽编码基因以及CD8a跨膜区和胞内区的编码基因拼接起来,获得膜表达型的IL-15编码基因(命名为mb15)。以pMX-pie为模板,利用PCR技术扩增小鼠Rae-1ε基因。将Rae-1ε基因和mb15基因分别插入真核表达载体pVITRO2-mcs的两个多克隆位点中,成功构建重组真核表达载体pV/mb15/RAE-1ε。用脂质体转染法将pV/mb15/RAE-1ε转染至BaF3细胞,通过潮霉素以及FACS分选后单克隆筛选的方法,获得稳定共表达膜型IL-15和Rae-1ε蛋白的BaF3细胞株,命名为BaF3/mb15/RAE。用类似的方法获得只表达膜型IL-15或Rae-1ε的BaF3细胞株,分别命名为BaF3/mb15和BaF3/RAE。第二部分：体外分析BaF3/mb15/RAE对IKDC生物学活性的影响用重组的小鼠GM-CSF和IL-4体外诱导小鼠骨髓细胞,得到成熟DC,将DC与丝裂霉素诱导凋亡的BaF3/mbl5/RAE细胞株共培养7天后,检测DC中IKDC的比例,结果发现,经BaF3/mb15/RAE细胞株刺激后,IKDC的比例出现明显增高。此外,利用流式分选DC中的IKDC (CD11cintB220+NK1.1+),将IKDC和丝裂霉素诱导凋亡的BaF3工程细胞株按1：1的比例共培养后,流式检测IKDC表面CD40、CD80、CD86、MHC-Ⅱ、NKG2D、FasL和TRAIL等膜表面分子的表达以及IFN-γ的分泌情况。结果发现,经BaF3-Rae-1ε-mIL-15细胞株刺激后,IKDC表面CD40、CD80、MHC-Ⅱ、NKG2D和FasL均出现不同程度的增加,尤以MHC-Ⅱ类分子的增加最为明显。总之,本研究成功构建了稳定共表达膜型IL-15和Rae-1ε的BaF3细胞株,该转基因细胞株能提高DC中IKDC的比例,并促进IKDC表面CD40、MHC-Ⅱ类分子和FasL等的表达,提示该转基因细胞株很可能具有增强IKDC提呈肿瘤抗原以及杀伤肿瘤细胞的能力,为其在抗肿瘤方面的应用提供了实验依据。