研究背景与目的循环microRNA是一类长度很短的内源性非编码RNA家族,由活细胞分泌并在各种体液（如血液、尿液和脑脊液）中保持稳定。循环microRNA的异常表达与肿瘤、心血管疾病等疾病密切相关。与一些传统的生物标志物相比,microRNA异常表达在肿瘤患者中可能出现的更早。因此,循环microRNA被认为是可能在前瞻性监测和临床筛检中有重要价值的生物标志物。由于体液中microRNA丰度低且长度短,因此检测时多使用酶催化的核酸扩增策略,如逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）、等温指数扩增（Isothermal exponential amplification）等。尽管这些策略灵敏且有效,但都需要一种或多种酶的参与,这增加了检测程序的复杂性及检测成本。此外,酶活性容易受到环境因素的影响,这提高了对检测环境的要求。相比之下,一些无酶方法更具成本效益、更简单和易于实施,因此具有很大研究价值。近年来,将无铜点击化学反应连接经过修饰的寡核苷酸探针作为信号放大策略引起了广泛的关注。与DNA或RNA连接酶相比,它依赖于叠氮化物（N3）和二苯并环辛炔（DBCO）之间的化学反应,表现出更好的相容性和更高的连接效率。在短链模板存在的情况下,点击化学反应可以在没有金属催化剂的情况下自发顺利进行,热循环的加入使得microRNA循环利用,实现第一次信号放大。为了实现点击化学连接反应的后续信号输出,磁珠分离,金纳米粒子聚集以及对连接产物进行加尾等一些策略已被研究,但相比之下,直接在反应后体系中加入三种发夹探针,构建可由点击化学连接产物触发的链置换介导的发夹堆叠DNA环路可以以一种更为简便和高性价比的方式实现信号输出并对信号进行二次放大,从而实现对microRNA进行准确的定量检测。本研究旨在基于这一设想构建一种基于点击化学连接触发链置换介导发夹堆叠的双循环信号放大生物传感平台,并将其用于循环microRNA的检测。研究方法1、设计用于循环点击化学连接反应的探针序列和用于发夹堆叠组装反应的DNA发夹序列,使用www.nupack.org对相应序列和产物结构进行分析。2、使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel Electrophoresis,PAGE）、原子力显微镜（Atomic Force Microscope,AFM）、荧光检测验证及背景信号来源分析对检测策略可行性进行分析。3、双循环信号放大检测的相关试验参数优化（1）循环点击化学反应的实验参数优化:依次优化点击化学探针的类型;点击化学探针的浓度;反应体系中Tween-20的浓度;点击化学连接热循环次数。（2）发夹堆叠组装的实验参数优化:依次优化DNA发夹toehold的有效碱基个数;DNA发夹的浓度;发夹堆叠组装反应时长。4、评估双循环信号放大策略的检测性能（1）确定双循环信号放大检测策略的检测线性范围和检测限。与单一发夹堆叠组装检测microRNA的检测灵敏度进行比较。（2）评估双循环信号放大检测策略的特异度,包括区分其他microRNA及碱基突变的能力,以及在复杂RNA混合物中定量低浓度靶标的能力。5、通过加标回收试验验证双循环信号放大检测策略在复杂生物样本（稀释血浆）中的检测能力。研究结果通过PAGE、有无靶标时荧光信号的差异、背景信号分析成功验证了双循环信号放大检测microRNA策略的可行性,并用AFM对最终的“Y”型DNA三聚体结构产物进行了成功表征。确定了传感平台的最优实验参数:使用DNA-N3探针和DNA-DBCO探针作为点击化学探针;点击化学探针浓度为200 n M;点击化学反应体系中Tween-20浓度为0.5%;热循环次数为70次;发夹探针toehold有效碱基数为5个;发夹探针浓度为700 n M,发夹堆叠反应时间为1.5 h。双循环信号放大策略的检测线性范围为20 p M-2 n M,检测下限为8.63 p M。相比于单一发夹堆叠组装检测microRNA检测下限低2个数量级。构建的检测平台具有识别碱基突变和在复杂microRNA混合物中准确定量靶标microRNA的能力。加标回收试验中,回收率为92.45%-108.92%,相对标准偏差为:2.14%-5.30%。说明其能在复杂血浆生物样本中发挥理想检测效果。结论本研究成功构建了一种基于点击化学连接触发链置换介导发夹堆叠的生物传感平台用于循环microRNA的灵敏、特异、准确检测。具有无需酶参与,无需铜催化,操作简单可控等优势。为无酶化学反应和无酶DNA环路在生物传感中的应用提供了新的思路。