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研究背景:颅内血肿的位置特殊,需要及时治疗,不然易导致脑组织不可逆的损伤以及神经功能恶化,更甚者可诱发脑疝造成死亡。血肿体积被证实是影响患者预后的关键因素,故在外科干预下进行血肿清除排出的治疗策略得到了临床广泛认可。因为传统开颅手术易损伤正常毗邻组织,影响患者预后,所以简单、易操作,创伤小的颅骨钻孔引流加纤溶药物灌洗的微创手术（Minimally invasive surgery,MIS）策略在临床应用中受到青睐,但是该微创治疗策略的血肿清除效率较低,所需置管引流时间较长,无形中增加了患者感染以及神经功能恢复不良的风险。各种体内外实验证实超声能通过其产生的空化效应显著增强溶栓药物的纤溶效果,因此,在MIS基础上联合超声的治疗策略,理论上能提高血肿的溶解排出效率,为患者带来更大收益。有研究者为提高血肿溶解效率,曾利用微创钻孔手术的方式将超声导管—一种用于血管内血栓溶解的超声设备,置入血肿病灶内部联合纤溶药物进行治疗,尽管最终结果显示血肿清除效率有明显提升,但超声导管辅助治疗的时间高达24h,限制了该策略的应用和发展。超声变幅杆是一种功率超声设备,相比超声导管,其末端的快速振动能在液体中产生更剧烈的空化效应,由此推测利用超声变幅杆联合纤溶药物来溶解清除血肿的治疗策略或许能取得更好的效果,满足临床需求。在此理论基础上,本课题组设计并定制了一款多参数可调的变幅杆式超声治疗设备—超声针,并在体外血肿模型中验证其联合纤溶药物溶解血凝块的作用机制以及探讨其不同工作参数组合以及与不同纤溶药物配合所产生的体外溶解效果差异。研究目的:1.体外验证超声针联合纤溶药物进行颅内血肿微创清除治疗的可行性以及其基本作用机制。2.探讨不同工作参数对超声针治疗策略的体外溶解效率的影响。3.探讨在超声针协同下,不同类型纤溶药物（尿激酶、瑞替普酶）的体外溶解效率差异。材料和方法:1、主要实验仪器1.1超声针:定制于江苏百航超声科技有限公司,主体为圆锥型变幅杆,尖端直径1.8mm,杆外附有直径2.5mm的针鞘用于药物注射至针尖。工作频率为29.62k Hz,主机面板有三个主要工作参数可调,分别为幅值Amplitude（%）,占空比（Duty cycle）DC（%）以及脉冲重复频率（Plus repetition frequency）PRF（Hz）。1.2微量输液泵:LD-P2020II,上海蓝德医疗器械有限公司。1.3电子天平:UTP-313,上海花潮电器有限公司。1.4 VINNO 70超声诊疗一体机:苏州飞依诺科技有限公司。2、主要实验试剂2.1无菌抗凝新生牛全血:500ml/瓶,北京索莱宝科技有限公司。2.2注射用尿激酶:100000IU/瓶,武汉人福药业有限责任公司。2.3细胞膜橙色荧光探针Dil（1,1’-双十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基吲哚羰花青高氯酸盐,1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate）:10mg/瓶,北京索莱宝科技有限公司。2.4注射用重组人组织型纤溶酶原激酶衍生物（瑞替普酶）:10mg/支,华润昂德生物药业有限公司。3、实验方法实验一:超声针联合尿激酶溶解体外血凝块及其机制研究（1）体外血凝块制备:将200μl 5%氯化钙溶液与10ml无菌抗凝新生牛全血混合于聚丙烯离心管模具（50ml离心管沿25ml刻度线切开制成）中,混合物在37℃恒温水浴锅中孵育3h形成血凝块,而后随机分配给各组,每组8个。（2）探讨超声针参数影响的治疗方案:超声针联合尿激酶溶解血凝块,期间固定超声针工作参数PRF（100Hz）,然后依次调节Amplitude（%）以及DC（%）,并记录治疗过程中的最高温度。之后比较各组血凝块溶解重量,筛选出效果最优的超声针工作参数。（3）最优参数下的治疗方案:超声针设置为最优参数,分别对超声针组,尿激酶组,超声针+生理盐水组以及超声针+尿激酶组进行治疗。（4）超声针的作用机制研究:观察细胞膜橙色荧光探针Dil在超声针作用下对血凝块组织内部的渗透情况,对照组,仅注射Dil;超声组,超声针治疗的同时注射Dil。（5）评价指标:①各组血凝块溶解重量以及溶解率。②荧光显微镜下Dil弥散范围。③扫描电镜:纤维蛋白溶解程度。④大体标本中溶解区域面积。实验二:尿激酶、瑞替普酶在超声针协同下的体外溶解效率比较（1）建立体外血肿模型:用无菌抗凝采血袋经肘静脉采集5名健康成年志愿者的血液,而后取25ml置于球囊中与500μl 5%氯化钙溶液以及20IU凝血酶混合,将球囊密封后置于37℃恒温水浴锅中孵育1.5h/12h/24h形成凝块,来自同一志愿者的血凝块被随机分给不同组。（2）治疗方案及分组:对照组,超声针组,尿激酶组,瑞替普酶组,超声针+尿激酶组以及超声针+瑞替普酶组。1.5h血凝块接受以上所有治疗方案,12/24h血凝块仅接受联合治疗方案。每次治疗完成后马上用测温针测量血凝块内部最高温度。（3）评价指标:①评价各组血凝块溶解效率:相对终末重量（治疗后重量/初始重量）。②二维超声观测下,血凝块治疗前后的面积变化。③纤维蛋白荧光染色结果以及血凝块组织HE染色结果。④扫描电镜:凝块表面纤维蛋白覆盖面积。实验结果实验一（1）参数讨论:血凝块溶解重量随Amplitude（%）和DC（%）的增加而增加,但在Amplitude（%）为40%和DC为20%时达到峰值（2.44±0.14g）,然后下降。Amplitude（%）和DC（%）越大,最高温度越高,其中DC（%）增加对温升的影响更大。（2）最优参数（PRF（100Hz）,Amplitude（40%）,DC（20%））下溶解效果:超声针+尿激酶组的溶解重量以及溶解率是尿激酶组的4倍余,并显著高于其他各组（P＜0.05）。（3）Dil渗透结果:经超声针作用后,血凝块组织被机械性破坏,间隙增宽,Dil渗透深远,镜下可见满视野荧光。（4）扫描电镜:与超声针组,尿激酶组相比,超声针+尿激酶组的血凝块中纤维蛋白丝溶解得更彻底。（5）大体标本观测结果:超声针+尿激酶组的血凝块溶解区域面积最大,显著高于尿激酶组（P＜0.05）。实验二（1）超声针辅助下的溶解效率提升:称重结果证实联合治疗组（超声针+尿激酶组,超声针+瑞替普酶组）的相对终末重量显著低于其余各单独治疗组（P＜0.05）。二维超声观测结果,HE染色以及纤维蛋白荧光染色结果也证实联合治疗组相对于其他各组,对血凝块组织有更强的破坏以及显著提升的溶解效果。（2）血凝块凝结时间对溶解效率的影响:扫描电镜下纤维蛋白丝的覆盖密度随凝血时间的增加而显著增加（1.5h vs 12h vs 24h,P＜0.05）,而对应的联合组的溶解效率依次显著降低（P＜0.05）。（3）药物溶解效率比较:尿激酶组与瑞替普酶组的溶解效率无差异（P＞0.05）,而超声针+瑞替普酶组的溶解效率始终显著高于超声针+尿激酶组（P＜0.05）。（4）温度变化:联合组引起的温升比尿激酶组,瑞替普酶组的更明显,且随着血块凝结时间增加,温升有轻微增加,但所有组的最高温度都低于超声针组（43.86±1.12℃）。结论1.超声针通过其针尖振动引起的机械效应破坏血凝块组织,促进纤溶药物渗透来加速血凝块溶解,为颅内血肿患者提供了一种潜在的微创超声辅助治疗策略。2.超声针的工作参数Amplitude（%）以及DC（%）过高会引起明显温升,降低最终溶解效果,而其中DC（%）的影响更显著。3.血凝块的凝结时间增加会降低超声针联合纤溶药物的体外溶解效率,但在超声针协同作用下,瑞替普酶的溶解效率始终显著高于尿激酶的溶解效率。