论文部分内容阅读
排尿的生理功能是排出代谢废物和维持体液平衡。中脑导水管周围灰质区（periaqueductal gray,PAG）和脑桥排尿中枢（pontine micturition center,PMC）能够支配膀胱逼尿肌,并且已证实这两个脑区之间存在解剖和功能上的连接。目前关于膀胱神经调控的观点是:PAG神经元在接收到大脑高级脑区做出的排尿决定后,通过直接投射并激活PMC来启动排尿反射。这些特异性投射至PMC的PAG神经元可能是排尿决定下传至PMC的“中继站”。根据功能学和解剖学分类,PAG被分为侧柱（lateral periaqueductal gray,LPAG）、腹外侧柱（ventrolateral periaqueductal gray,VLPAG）、背内侧柱（dorsomedial periaqueductal gray,DMPAG）和背外侧柱（dorsolateral periaqueductal gray,DLPAG）,其中腹外侧柱（VLPAG）在控制排尿中发挥了主要作用。一般观点认为,VLPAG通过投射至PMC来控制排尿和膀胱收缩,然而,特异性投射至PMC的VLPAG神经元的确切位置以及这群神经元在排尿发生时或排尿周期中的活动模式尚未被阐明。与条件依赖性排尿（主动排尿）相关的VLPAG神经元的上游输入仍然不清楚。针对上述这些问题,在本课题中,我们主要通过嗜神经病毒逆行标记的神经环路示踪技术、光纤光度法记录Ca2+信号以及同步膀胱测压的实验,对VLPAG神经元在排尿活动中的作用进行了初步研究。本课题主要开展的实验如下:（1）为了明确支配膀胱逼尿肌的VLPAG神经元的解剖学分布情况,我们开展了伪狂犬病毒（pseudorabies virus,PRV）介导的逆行跨多级标记神经环路示踪的实验。（2）为了明确特异性投射至PMC的VLPAG神经元的分布情况,我们在CRH-Cre转基因小鼠中通过细胞特异性的狂犬病毒（rabies virus,RV）系统,开展了RV介导的逆行跨单级突触示踪的实验。（3）为了探究特异性投射至PMC的VLPAG神经元在小鼠排尿过程中的活动特征,我们在小鼠脑内植入光纤,并利用光纤光度法同步记录这群VLPAG神经元的活动和自由运动小鼠的排尿事件。（4）为了进一步研究小鼠膀胱收缩是否与特异性投射至PMC的VLPAG神经元的活动高度相关,我们进行了光纤光度法记录这群VLPAG神经元的Ca2+信号并同步膀胱测压的实验。（5）为了解析特异性投射至PMC的VLPAG神经元在全脑范围内的上游输入,我们开展了狂犬病毒（RV）介导的逆行跨单级突触示踪实验,并对被RV标记的主要脑区进行了细胞计数。本课题主要的发现如下:1.明确了支配小鼠膀胱逼尿肌的VLPAG神经元的分布情况。将表达绿色荧光蛋白的伪狂犬病毒531（PRV531）注射至成年小鼠的膀胱逼尿肌,逆行感染大脑内参与控制膀胱的VLPAG神经元。根据与小鼠脑图谱（《The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates》,2012版）比对,我们发现:PRV531逆行标记的神经元在VLPAG脑区内广泛分布（Bregma-4.12～-5.20 mm）。进一步的分析显示,这些参与支配膀胱逼尿肌的VLPAG神经元主要集中在Bregma-4.48～--4.96 mm的范围内。总而言之,这些结果表明支配膀胱逼尿肌的VLPAG神经元广泛分布于整个VLPAG中并且集中在内侧和尾侧区域。2.明确了特异性投射至PMC的VLPAG神经元的分布情况。通过对CRH-Cre转基因小鼠进行细胞特异性RV的逆行示踪实验。我们发现:RV标记的特异性投射至PMCCRH的VLPAG神经元广泛分布于整个同侧VLPAG（Bregma-4.12～-5.20 mm）中。对同侧VLPAG中被RV标记的神经元数目做定量统计显示:大部分投射至PMCCRH的VLPAG神经元集中在VLPAG的内侧和尾侧区域（Bregma-4.48～-4.96 mm）。平均细胞数为15±1（Bregma:-4.72 mm）～-121±7（Bregma:-4.72 mm）。总之,这部分实验对特异性投射至PMCCRH的VLPAG神经元进行了精准定位。基于我们发现的这群VLPAG神经元核心位置的坐标（Bregma-4.48～-4.96 mm）,我们将进行下一步的光纤记录实验。3.特异性投射至PMC的VLPAG神经元集群的Ca2+信号与排尿事件高度相关。我们发现:在每一次排尿开始前,实验组（特异性投射至PMC的VLPAG神经元表达GCa MP6f）中GCa MP6f的荧光强度即出现显著增加,然而对照组（特异性投射至PMC的VLPAG神经元表达EGFP）中EGFP的荧光强度在排尿发生前后始终没有变化。这表明实验组小鼠所记录到GCamp6f的信号变化与排尿事件高度相关且不是由运动伪影造成的。在所有的光纤记录试验中,每个排尿事件都与GCamp6f标记的VLPAG神经元的Ca2+信号瞬变相对应。我们这些数据表明:特异性投射至PMC的VLPAG神经元集群的Ca2+信号与排尿事件高度相关。4.膀胱收缩时,特异性投射至PMC的VLPAG神经元的活动增加。为了进一步研究特异性投射至PMC的VLPAG神经元Ca2+信号的变化是否与膀胱收缩相一致,我们在自由运动的小鼠中同时进行光纤记录和膀胱压力监测。我们发现,实验组（特异性投射至PMC的VLPAG神经元表达GCa MP6f）中,每一次VLPAG神经元活动的显著增加都与膀胱压力骤升（膀胱收缩）相关。相比之下,在膀胱压力变化过程中,我们没有发现对照组（特异性投射至PMC的VLPAG神经元表达EGFP）中VLPAG神经元出现荧光强度的变化。排尿周期中的平均Ca2+信号显示,在膀胱压力骤升时,VLPAG神经元同时发生Ca2+信号瞬变。每次膀胱收缩都与投射至PMC的VLPAG神经元集群的Ca2+活动相关,相关性为100%。VLPAG神经元的Ca2+信号与膀胱压力的相关性分析也显示,VLPAG神经元集群的Ca2+活动与膀胱逼尿肌收缩密切相关（GCa MP6f data,0.61±0.04;shuffled data,0.14±0.01;P＜0.05）。这些结果表明,特异性投射至PMC的VLPAG神经元的活动与膀胱收缩高度相关。5.特异性投射至PMC的VLPAG神经元接收全脑多个区域的解剖学输入。在本实验中,我们通过RV介导的逆行跨单级突触示踪的方法发现了许多特异性投射至PMC的VLPAG神经元的上游输入脑区。我们对这些脑区中被RV标记的神经元数目进行统计分析（仅统计RV注射位点同侧的大脑半球）,根据平均细胞数由高到低列出以下15个最主要的上游脑区:下丘脑外侧区（lateral hypothalamic area,LH）、未定带（zona incerta,Zi）、下丘脑内侧视前区（medial preoptic area,MPOA）、黑质网状部（substantia nigra pars reticulate,SNR）、终纹床核（bed nucleus of the stria terminalis,BNST）、中央杏仁核（central amygdalar nucleus,Ce A）、臂旁核（parabrachial nucleus,PBN）、黑质致密部（substantia nigra pars compacta,SNC）、内侧前额叶皮层（medial prefrontal cortex,m PFC）、脑桥排尿中枢（PMC）、外侧网状核（lateral reticular nucleus,LRt）、初级感觉皮层（primary somatosensory cortex,S1）、前扣带回（anterior cingulate cortex,ACC）、初级运动皮层（primary motor cortex,M1）、下丘脑室旁核（paraventricular nucleus,PVN）。上述脑区中,被RV标记的神经元平均数目范围是57±5（PVN）至931±16（LH）。这些结果为解析特异性投射至PMC的VLPAG神经元介导的条件依赖性排尿（主动排尿）提供了解剖学线索。本课题主要的结论如下:通过本课题的开展,我们明确了支配膀胱逼尿肌的VLPAG神经元和特异性投射至PMC的VLPAG神经元均广泛分布于整个VLPAG;并证实了这群特异性投射至PMC的VLPAG神经元的活动与排尿和膀胱收缩高度相关;最后,我们揭示了这群VLPAG神经元可接收多个排尿相关上游高级脑区（如下丘脑内侧视前区、下丘脑外侧区和内侧前额叶皮层等）的解剖学输入。综上所述,我们的发现为解析VLPAG神经元在调控排尿中的功能提供了新的见解,也为神经源性的膀胱功能障碍诊治提供了一个具有潜在价值的大脑节点。