【摘 要】
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本文选用毕赤酵母X-33作为宿主,分别对黄曲霉来源、微细菌ZZJ4-1来源、假丝酵母来源、枯草芽孢杆菌来源的尿酸氧化酶基因进行了异源表达,通过对胞内胞外酶活的测定,发现黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因在毕赤酵母X-33中的表达量以及分泌量最高,胞外酶活为0.122 U/m L,胞内酶活为1.6 U/m L,因此选用了黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因作为目的基因。为了使更多的酶分泌到胞外,对酿酒酵母α-MF信号
【基金项目】
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国家重点研发计划（2018YFA0900201,2019YFB1503904）；
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本文选用毕赤酵母X-33作为宿主,分别对黄曲霉来源、微细菌ZZJ4-1来源、假丝酵母来源、枯草芽孢杆菌来源的尿酸氧化酶基因进行了异源表达,通过对胞内胞外酶活的测定,发现黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因在毕赤酵母X-33中的表达量以及分泌量最高,胞外酶活为0.122 U/m L,胞内酶活为1.6 U/m L,因此选用了黄曲霉来源的尿酸氧化酶基因作为目的基因。为了使更多的酶分泌到胞外,对酿酒酵母α-MF信号肽进行了优化,以及对内源信号肽和外源信号肽进行了大量的筛选,包括10种内源信号肽和8种外源信号肽。在初始α-MF信号肽的作用下,摇瓶中的胞外酶活为0.122 U/m L,5 L生物反应器中的胞外酶活为0.201 U/m L。在经过大量筛选之后得到了2种对于尿酸氧化酶分泌性较强的信号肽,分别是信号肽Fre 2和信号肽Dse 4,摇瓶中胞外酶活分别为0.474 U/m L和0.426 U/m L,相对α-MF信号肽分别提高了3.88倍和3.5倍。在5 L生物反应器中的胞外酶活分别为10.8 U/m L和8.4 U/m L,分别是α-MF信号肽分泌效果的51.4倍和41.8倍。在以Fre 2作为分泌信号肽的基础之上,对尿酸氧化酶分泌途径中的相关模块进行了优化,包括转录因子模块、内质网分子伴侣模块、易位蛋白模块、囊泡COPⅡ转运模块、泛素化模块、磷酸戊糖途径模块、抗氧化模块七个模块进行了探究,发现对于尿酸氧化酶的分泌有较大促进作用的是囊泡COPⅡ模块的Sar 1蛋白,对Sar 1过表达之后,胞外酶活为0.662U/m L,相对提高了39.7%,过表达Uso1后,胞外酶活为0.597 U/m L,相对提高了25.9%,易位蛋白相关的YDJ 1、Sec 61过表达之后胞外酶活分别为0.637 U/m L,0.6 U/m L,分别提高了34.4%、26.6%。在5 L生物反应器中菌株XFU-Sar 1、XFU-Uso 1、XFU-Sec 61、XFU-YDJ 1的胞外最高酶活分别达到11.4 U/m L、10.96 U/m L、10.86 U/m L、11.2 U/m L。推断过表达相关基因后的菌株在5 L生物反应器中的胞外酶活没有明显提高的原因是发酵后期前体供应不足或者分泌受限。
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