髓鞘是神经电冲动沿轴突快速传递的结构基础,在中枢神经系统（Central nervous system,CNS）中,成熟的少突胶质细胞（Oligodendrocytes,OLs）是形成髓鞘的细胞,由少突胶质前体细胞（Oligodendrocyte precursor cells,OPCs）分化产生。在脊椎动物幼年发育过程中,OPCs经过增殖迁移到中枢神经系统的白质部位,分化为形成髓鞘的少突胶质细胞,起始髓鞘的形成。成年后髓鞘损伤修复的过程与发育类似,静息状态的OPCs被激活并迅速迁移到病变部位,增殖、分化成为新的OLs,重新包裹轴突形成新的髓鞘。健康神经系统的髓鞘脱失和再生是自发的,其动态平衡保证了髓鞘正常的生理功能。CNS脱髓鞘疾病是一类以髓鞘损伤或形成（再生）障碍为主要特征的疾病,确切的病因及发病机制迄今不明,涉及免疫、遗传易感性、衰老和环境等诸多复杂因素。病理学研究显示,临床最为常见的脱髓鞘疾病——多发性硬化症（Multiple sclerosis,MS）患者的慢性病变区存在着大量不能正常分化成熟的OPCs,提示OPCs分化失能可能是抑制髓鞘修复的关键因素。因此,解析生理或病理情况下调控OPCs分化以及髓鞘形成/再生的分子机制,对于寻找促进髓鞘损伤修复的治疗靶点和候选药物具有重要的理论价值和临床意义。基于上述背景,本研究首先以病理学特征为依据,以基因芯片测序技术为基础,通过构建炎性脱髓鞘动物模型——实验性自身性脑脊髓炎（Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）,绘制其中枢病变部位失能OPCs的基因表达谱,通过功能基因挖掘筛选出以过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ）为代表的一系列调控髓鞘再生的候选关键分子,为系统研究OPCs分化及髓鞘再生的分子机制奠定了基础;进一步结合候选基因PPARγ的功能信息,明确其在OPCs发育和髓鞘形成/再生过程中的表达模式;最后利用药理激活和干扰表达的方式,揭示了PPARγ对OPCs分化的正向调控作用,明确了激活PPARγ在髓鞘生成和脱髓鞘模型中对髓鞘发育和再生的直接促进作用。主要研究方法和结果如下:1、EAE脱髓鞘病灶区失能OPCs基因表达模式分析通过分离纯化疾病高峰期EAE小鼠脊髓中的OPCs进行表达谱测序和生物信息分析,我们发现脱髓鞘病灶区聚集的失能OPCs基因表达模式显著区别于健康小鼠,差异表达基因的功能主要与中枢神经系统胶质细胞分化、髓鞘形成、细胞骨架组装、脂质代谢、免疫反应等生物学过程高度相关;分子功能GO分析表明,差异基因包含多个转录因子和受体;通过共富集参与中枢神经系统发育、胶质细胞生成与分化、脂质代谢过程的差异表达基因,联合功能性转录因子预测,我们筛选出以PPARγ为代表的多个具有潜在促OPCs分化作用的候选功能基因,为深入探究其在OPCs分化以及髓鞘形成/再生的分子机制奠定了基础。2、PPARγ在OPCs分化和髓鞘形成/再生过程中的表达模式研究针对筛选出的具有显著表达变化的转录因子和受体基因,首先利用q-PCR验证差异基因在EAE和Cuprizone脱髓鞘模型以及髓鞘形成模型中的表达变化。以Pparγ为例,表达分析结果显示Pparγ在小鼠髓鞘形成/再生过程中的表达变化与已知的OPCs发育关键调控基因Olig2和Sox10的表达模式正相关,提示PPARγ可能在少突胶质细胞发育过程中具有重要作用。然后对纯化的原代OPCs进行诱导分化培养,发现伴随着OPCs向OLs的分化成熟,Pparγ的表达显著增强;通过免疫荧光染色共定位PPARγ与OPC标记物PDGFRα、成熟OL标记物CC1、星形胶质细胞标记物GFAP和神经元标记物Neu N,发现与离体培养实验结果一致,PPARγ在少突胶质谱系细胞中广泛表达,在星形胶质细胞和神经元中部分表达,说明PPARγ作为转录调控因子在中枢神经系统中具有功能多样性,在少突胶质细胞发育调控过程中可能具有功能特异性。进一步比较小鼠出生后7天、14天和21天脊髓白质内PPARγ在NG2+OPCs以及CC1+OLs中的表达变化,发现PPARγ在少突胶质谱系细胞中的表达趋势与小鼠髓鞘发育水平正相关;在炎性脱髓鞘模型EAE和LPC诱导的局部脱髓鞘模型中,PPARγ在髓鞘损伤区NG2+/PDGFRα+OPCs和CC1+OLs中显著表达,提示其在脱髓鞘和髓鞘再生过程中可能的重要作用。3、PPARγ在OPCs分化和髓鞘形成/再生过程中的功能研究已知PPARγ在糖脂代谢中具有关键作用,是胰岛素增敏剂的作用靶点,罗格列酮（Rosiglitazone,Rosi）是已知的PPARγ选择性药理激动剂,能够有效增强PPARγ的活性。在小鼠原代OPCs培养体系中添加Rosi,可显著促进OPCs向OLs分化,表现为CNPase+OLs细胞突起生长、细胞膜结构和形态更为复杂。采用RNA干扰的方法下调OPCs中PPARγ的表达,发现在诱导分化的培养条件下,OPCs的分化成熟被抑制,细胞突起减少,细胞膜复杂程度降低。以上结果进一步证实,PPARγ在OPCs向成熟OLs发育的过程中发挥正调节作用。对髓鞘发育未完成的新生小鼠给予Rosi连续给药处理,发现与未处理对照相比,脑胼胝体区髓鞘蛋白MBP的表达显著增强,髓鞘包裹的轴突数量显著增加,脑胼胝体和脊髓白质区CC1+的成熟OLs数量明显增多,说明Rosi激活的PPARγ是髓鞘形成的正调控因子。对Cuprizone诱导的毒性脱髓鞘小鼠,在髓鞘再生阶段给予Rosi治疗,通过LFB染色、MBP免疫荧光染色以及透射电镜检测均发现Rosi处理显著促进了髓鞘再生,表现为Rosi组胼胝体LFB染色区域和MBP表达显著增多,髓鞘包裹的轴突数量增加,髓鞘厚度增加,说明活化的PPARγ对髓鞘再生过程也有积极作用。进一步统计脱髓鞘损伤部位少突胶质细胞数量的变化,发现小鼠脑胼胝体区单位面积内CCI+OLs的数目显著增加,PDGFRα+OPCs的数量减少,但激活的GFAP+星形胶质细胞以及Iba1+小胶质细胞的数目并没有显著变化。动物运动能力测试（平衡木、紧绳和旋转测试棒）结果显示,Rosi可以部分恢复由Cuprizone导致的小鼠运动协调功能的损伤。上述结果证明Rosi激活的PPARγ在OPCs成熟和髓鞘形成/再生过程中发挥了正调控作用。综上所述,本研究证明了PPARγ是一个潜在的OPCs分化调控分子,具有直接促进髓鞘形成和再生的重要生理功能。研究结果可为脱髓鞘疾病的治疗提供新的靶点（PPARγ）和候选药物（罗格列酮）。