【摘 要】
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昆虫表皮是由上皮细胞分泌的几丁质和表皮蛋白质等成分交联形成,对昆虫虫体起着支撑、保护内部组织和防止水分散失的作用。然而,由于缺乏延展性,表皮又会限制昆虫的生长。为了摆脱旧表皮对生长的束缚,昆虫在发育过程中会经历多次蜕皮。昆虫蜕皮是由一系列高度程序化事件推进的,包括旧表皮的降解,新表皮的形成,蜕皮和新表皮着色等。前人研究表明这些蜕皮进程与蜕皮激素“脉冲”的分泌模式直接相关。在蜕皮前期,血液内激素浓度
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昆虫表皮是由上皮细胞分泌的几丁质和表皮蛋白质等成分交联形成,对昆虫虫体起着支撑、保护内部组织和防止水分散失的作用。然而,由于缺乏延展性,表皮又会限制昆虫的生长。为了摆脱旧表皮对生长的束缚,昆虫在发育过程中会经历多次蜕皮。昆虫蜕皮是由一系列高度程序化事件推进的,包括旧表皮的降解,新表皮的形成,蜕皮和新表皮着色等。前人研究表明这些蜕皮进程与蜕皮激素“脉冲”的分泌模式直接相关。在蜕皮前期,血液内激素浓度快速增加,到达高峰后又迅速恢复正常水平。目前,已有一些蜕皮激素相关调控因子被证实能参与昆虫的蜕皮过程。然而,从全基因组层面探究各蜕皮进程的分子调控机制还少有报道。在蜕皮激素脉冲分泌模式下,响应不同激素浓度的调控网络也还有待鉴定,尤其是当蜕皮激素滴度由峰值开始降低时,有哪些激素响应因子参与新表皮的形成需要进一步地研究。为此,本研究首先针对不同家蚕幼虫蜕皮时期进行时序性转录组,分析不同发育时期的基因调控网络。进一步,通过染色质可及性测序鉴定出蜕皮前期和后期的关键转录因子,并对其在幼虫蜕皮激素过程中的功能进行验证。所取得主要结果如下:1,时序性RNA-seq鉴定蜕皮相关基因通过研究家蚕四龄蜕皮期表皮的组织学变化,我们发现旧表皮的降解发生在蜕皮激素滴度上升过程（B和C1期）;而新表皮形成则发生在蜕皮激素滴度下降的过程（E1和E2期）。基于时序性转录组数据,我们鉴定了与旧表皮降解和新表皮形成相关的基因。在旧表皮降解过程（B-D期）,蛋白酶和几丁质降解相关酶显著高表达。而参与新表皮形成相关的表皮蛋白,几丁质合成酶,氨基酸转运蛋白和色素合成基因等,大多在E1和E2时期高表达。若人为增加E1和E2时期蜕皮激素滴度,则会显著抑制表皮形成相关基因的表达。此外,做为最主要的表皮结构组成单元,基因组上成簇排列的表皮蛋白基因呈现典型的共表达现象。进一步,通过基因共表达网络分析,本研究发现Bmftz-f1（Nuclear hormone receptor ftz-f1）及另一个新转录因子Bm CEBP（CCAAT/enhancer-binding protein）与新表皮合成相关基因共表达的转录因子,暗示它们可能参与新表皮的形成。2,ATAC-seq鉴定新表皮形成关键调控因子为了阐明蜕皮相关基因转录水平变化的调控机制,我们通过ATAC-seq技术来鉴定家蚕蜕皮前期（C1时期）和后期（E2时期）的关键调控因子。通过差异开放分析,我们发现C1时期开放peak邻近基因主要为蛋白和几丁质降解基因,而E2时期开放peak邻近基因主要为表皮蛋白基因。Motif富集分析表明,C1时期开放peak最富集的motif对应为Bm ECR-USP和Bm GRH两个转录因子,而E2时期开放peak最富集的motif对应Bmftz-f1和Bm CEBP两个转录因子。结合第一部分基因共表达网络分析结果,新表皮形成过程的基因主要由Bmftz-f1和Bm CEBP来调控,旧表皮降解过程的基因主要由Bm ECR-USP和Bm GRH来调控。3,敲除Bm CEBP与Bmftz-f1导致家蚕蜕皮缺陷为了验证Bm CEBP和Bmftz-f1对家蚕新表皮形成的影响,我们分别通过完全敲除（nosp-Cas9驱动）和表皮特异性敲除系统（G25p-Cas9）来对两者进行功能研究。两种敲除方法都证实了Bm CEBP和Bmftz-f1是家蚕蜕皮所必需的。Bmftz-f1KO和Bm CEBPKO都表现出严重的蜕皮缺陷,绝大部分敲除个体在蜕皮期死亡。与对照个体相比,Bmftz-f1KO和Bm CEBPKO＿G25p表现出体型减小的表型。我们猜测,在敲除个体中,表皮蛋白和几丁质合成基因的表达下调,从而导致家蚕出现新形成的表皮延展性变小和蜕皮缺陷的表型。Bmftz-f1KO和Bm CEBPKO＿G25p也表现出体色的变化,可能是由于色素合成基因表达受到影响。通过突变体与对照个体的RNA-seq比较,我们验证上述结论。通过多种数据整合,我们发现,Bm CEBP和Bmftz-f1共同调控了新表皮合成相关基因的表达。综合以上实验结果,通过RNA-seq和ATAC-seq等多组学数据联合分析,我们刻画了家蚕幼虫蜕皮过程中,旧表皮降解和新表皮形成等进程的分子调控网络,并从中鉴定了两个调控新表皮形成的关键因子,最终利用基因敲除方法证实它们在幼虫蜕皮过程中的重要功能。本文的研究结果将拓展我们对昆虫由蜕皮激素脉冲所介导的幼虫蜕皮分子调控网络的认知,有重要的基础理论意义。另外,对幼虫蜕皮调控机制的研究,也将有助于探寻农林害虫的防治新靶标,有重要实践意义。
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