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目的:神经母细胞瘤（neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外恶性实体肿瘤,起源于神经嵴,发病率仅有15/百万,却占据儿童肿瘤相关死亡的15%。神经嵴细胞大致可分为四种功能类型:迷走神经和骶骨细胞、颅骨细胞、心脏细胞和躯干细胞。躯干神经嵴的细胞通过上皮间质转化从神经管迁移到背主动脉,分化形成交感-肾上腺前体细胞,最终形成周围神经系统的细胞,包括交感神经节和肾上腺,是NB发生的主要部位。理论上,NB可以发生在任何交感神经系统,大约一半以上的NB发生在肾上腺,其他常见的部位主要包括颈部,胸部,以及盆腔。临床上出现的症状和体征主要取决于原发肿瘤的位置,以及是否出现转移或者副肿瘤综合征。根据NB的肿瘤分期与其他预后因素,包括诊断时的年龄、病理和基因组特征（包括MYCN扩增、11号染色体的状态等）,国际神经母细胞瘤风险分组系统将神经母细胞瘤患者分为低危组、中危组和高危组。其中,低危组和中危组的患者经过常规的抗肿瘤治疗和对症治疗预后很好,5年总体生存率能达到90%以上,然而对于高危组患者而言即使综合化疗、手术切除、放疗、自体干细胞移植以及免疫治疗等,预后依然很差,五年生存率低于40%。化疗耐药是高危组NB治疗的难点,也是临床上最终治疗失败的主要原因。因此,寻找新的治疗药物作用靶点,提高NB患者的的化疗敏感性,改善NB患者的预后尤为重要。AKT活化与NB患者差的的预后密切相关,Perifosine作为一种新型AKT抑制剂,我们前期研究发现,Perifosine在体外实验能够明显抑制神经母细胞瘤细胞的存活、迁移和侵袭,而在小鼠荷瘤实验中发现Perifosine作为单药就能够显著抑制肿瘤的生长,延长小鼠生存期。另外,在Perifosine对复发难治性的神经母细胞瘤的I期临床实验中发现,不仅毒性低而且耐受性好,并且作为单药就表现出良好的治疗效果。综合凯特琳癌症中心的I期临床实验和课题组的一系列的体内外研究,Pperifosine对于神经母细胞瘤的临床治疗具有重大的潜力。另外,多项研究发现Perifosine还能够通过抑制MAPK、WNT等信号通路,对乳腺癌、肺癌、结直肠癌、前列腺癌以及多发骨髓瘤等都表现出良好的抗肿瘤效果。为了进一步探究Perifosine在NB中的抗肿瘤的机制,我们课题组前期通过对Perifosine处理后的NB细胞进行蛋白质组学检测,结合生物信息分析发现脊髓小脑共济失调3型蛋白（ATXN3）作为研究的靶分子。脊髓小脑共济失调3型蛋白（ATXN3,也被称为Ataxin-3,ATX3,或者MJD）蛋白分子量约为42 k Da,主要定位在细胞核和线粒体。ATXN3属于脊髓小脑共济失调蛋白家族的成员,它是半胱氨酸去泛素化酶的五个主要家族成员之一,主要参与蛋白质稳态维持、基因转录、细胞骨架稳定调节、细胞发生和异常折叠蛋白的伴侣底物的降解。ATXN3是脊髓小脑共济失调疾病发生发展过程中最关键的核心基因,另外研究发现在肺癌和乳腺癌中ATXN3能够直接调控P53和PTEN的稳定性,并且能够调节自噬核心基因Beclin 1的表达影响细胞的自噬过程,然而ATXN3在NB中的作用以及是否影响NB对药物的敏感性尚未见报道。本研究主要探究ATXN3不同表达水平影响NB细胞对小分子AKT抑制剂（Perifosine和MK-2206）以及化疗药物（依托泊苷和顺铂）的敏感性及机制,从而为临床治疗NB患者的药物选择提供理论指导。研究方法:本研究主要使用SK-N-AS和SK-N-BE2两种细胞系。通过NCBI-GEO、TCGA、GTEx和R2数据库分析ATXN3的表达与NB患者临床病理资料以及患者预后的关系。利用western blot检测细胞中ATXN3、BCL-2家族的蛋白表达水平。通过转染小干扰RNA（si RNA）或者过表达质粒来上调或者下调ATXN3的表达水平,研究ATXN3不同表达水平影响神经母细胞瘤细胞对小分子AKT抑制剂（Perifosine和MK-2206）和化疗药物（依托泊苷和顺铂）的敏感性。转染ATXN3si RNA后,给予小分子AKT抑制剂（Perifosine和MK-2206）和化疗药物（依托泊苷和顺铂）处理,通过Incucyte Zoom活细胞动态成像系统,分析各组的不同时间点细胞的融合率曲线,间接反映神经母细胞瘤细胞增殖情况。利用CCK8技术检测各组的细胞的吸光度,观察细胞活力,反映细胞的增殖情况。通过Annexin V/PI双染色,利用流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。通过Graph Pad Prism 8软件进行统计分析。结果:1.ATXN3的表达水平与NB患者的MYCN扩增的状态、风险分组以及肿瘤分期显著负相关,而且ATXN3是NB患者的一个独立预后影响因素（风险比为0.74,95%置信区间为0.57-0.86,P值为0.0383）。2.下调ATXN3表达水平增强NB细胞对AKT抑制剂（Perifosine和MK-2206）的敏感性。通过在NB细胞中转染ATXN3 si RNA片段（AS:ATXN3 si RNA#1和#2;BE2:ATXN3 si RNA#2,标记为ATXN3 si RNA）以下调ATXN3的表达水平,然后给予AKT抑制剂（Perifosine或者MK-2206）处理48小时后,进行相关检测,如下结果:（1）利用Incucyte Zoom活细胞动态成像系统分析细胞融合率曲线发现:在Perifosine或者MK-2206处理的条件下,下调ATXN3组细胞融合率曲线明显低于对照组。对AKT抑制剂处理48小时的各组细胞融合率进行统计分析发现:与对照组相比较,Perifosine处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3si RNA#2组vs对照组细胞融合率:51.6%和30.6%vs 77.5%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组的细胞融合率:38.1%vs 60.8%,P值<0.01。在MK-2206处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3si RNA#2组vs对照组的细胞融合率:48.9%和42.6%vs 65.3%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组细胞融合率:46.9%vs 75.2%,P值<0.01。（2）利用CCK8方法检测细胞活性发现:在Perifosine处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞存活率:46.3%和39.9%vs 68.9%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组细胞存活率:33.6%vs 59.2%,P值<0.01;在MK-2206处理的条件下:SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1,ATXN3 si RNA#2组vs对照组的细胞存活率:51.2%和41.5%vs 69.5%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组细胞存活率:44.5%vs 69.3%,P值<0.01。（3）利用流式细胞仪对Annexin V/PI双染细胞进行凋亡细胞检测发现:在Perifosine处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞凋亡率:24.7%和29.8%vs 16.8%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组细胞凋亡率:27.7%vs 15.9%,P值<0.01;在MK-2206处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞凋亡率:31.4%和37.0%vs 16.1%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3si RNA组vs对照组细胞凋亡率:23.0%vs 16.3%,P值<0.01。3.BIM部分介导了ATXN3影响NB细胞对AKT抑制剂（Perifosine和MK-2206）的敏感性。（1）Western blot检测发现,相对于单独沉默ATXN3或者单独给予Perifosine或者MK-2206处理,下调ATXN3的表达联合Perifosine或者MK-2206处理后,能够显著促进BIM的表达。（2）NB细胞中同时转染ATXN3 si RNA及BIM si RNA以下调ATXN3和BIM的表达水平,给予AKT抑制剂（Perifosine或者MK-2206）处理48小时后发现:（2.1）细胞融合率曲线分析显示:在AKT抑制剂（Perifosine或者MK-2206）处理的条件下,联合下调ATXN3和BIM组的细胞融合率曲线明显高于单独下调ATXN3组的细胞融合率曲线。对各组细胞在AKT抑制剂处理48h时间点的融合率进行统计分析发现:在Perifosine处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA联合BIM si RNA组vs ATXN3 si RNA组细胞融合率:75.5%vs 51.9%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA联合BIM si RNA组vs ATXN3 si RNA组细胞融合率:56.6%vs 38.1%,P值<0.01。在MK-2206处理的条件下:SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA联合BIM si RNA组vs ATXN3 si RNA#2组细胞融合率:55.5%vs41.0%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA联合BIM si RNA组vs ATXN3 si RNA组细胞融合率:64.8%%vs 52.6%,P值<0.01。（2.2）利用CCK8对细胞活性检测结果显示:在小分子AKT抑制剂（Perifosine或者MK-2206）处理的条件下,与单独下调ATXN3组相比较,下调ATXN3的同时沉默BIM组的细胞存活率显著升高。在Perifosine处理的条件下:SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA联合BIM si RNA组vs ATXN3 si RNA组细胞融合率:66.2%vs48.8%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA联合BIM si RNA组vs ATXN3si RNA组细胞融合率:60.8%vs 33.6%,P值<0.01。在MK-2206处理的条件下:SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA联合BIM si RNA组vs ATXN3 si RNA组细胞融合率:60.3%vs 45.5%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA联合BIM si RNA组vs ATXN3 si RNA组细胞融合率:62.7%vs 44.5%,P值<0.01。4.下调ATXN3的表达水平降低NB细胞对化疗药物（依托泊苷和顺铂）的敏感性。将ATXN3 si RNA#1和#2转染到AS细胞中,将ATXN3 si RAN#2转染到BE2细胞中（标记为ATXN3 si RNA）,然后给予化疗药物（依托泊苷和顺铂）处理48小时后,进行相关检测,结果显示:（1）利用Incucyte Zoom活细胞动态成像系统分析细胞融合率曲线发现:在依托泊苷或者顺铂处理的条件下,下调ATXN3组细胞的融合率曲线明显高于对照组。对依托泊苷和顺铂处理48小时后各组细胞融合率进行统计分析发现:在依托泊苷处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞融合率:83.3%和74.5%vs 46.2%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3si RNA组vs对照组细胞融合率:80.1%vs 58.3%,P值<0.01。在顺铂处理的条件下:SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞融合率:53.6%和60.3%vs 29.4%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组细胞融合率:63.3%vs 35.2%,P值<0.01。（2）利用CCK8方法检测细胞活性发现:在依托泊苷处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞存活率:48.0%和55.1%vs 22.5%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组细胞存活率:75.7%vs 56.3%,P值<0.01;在顺铂处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞存活率:41.2%和36.8%vs 18.7%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组细胞存活率:51.1%vs30.0%,P值<0.01。（3）利用流式细胞仪对Annexin V/PI双染细胞进行凋亡细胞检测发现:在依托泊苷处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞凋亡率:24.1%和27.7%vs 38.4%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3 si RNA组vs对照组细胞凋亡率:19.1%vs 28.8%,P值<0.01;在顺铂处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,ATXN3 si RNA#1和ATXN3 si RNA#2组vs对照组细胞凋亡率:27.4%和23.3%vs 46.1%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,ATXN3si RNA组vs对照组细胞凋亡率:22.8%vs 34.2%,P值<0.01。5.Bcl-xl部分介导了ATXN3影响NB细胞对依托泊苷和顺铂的敏感性。在SK-N-AS和SK-N-BE2细胞,同时转染ATXN3 si RNA及Bcl-xl si RNA以下调ATXN3和Bcl-xl的表达水平,给予化疗药物（依托泊苷或者顺铂）处理48小时后发现:（1）下调ATXN3表达的同时沉默Bcl-xl,并分别给予依托泊苷和顺铂处理48小时后,结合细胞融合率曲线分析发现:依托泊苷和顺铂处理的条件下,联合下调ATXN3和Bcl-xl组的细胞融合率曲线显著低于单独下调ATXN3组的细胞融合率曲线。对药物处理48小时后各组细胞融合率进行统计分析发现:在依托泊苷处理的条件下:ATXN3 si RNA联合Bcl-xl si RNA组vs ATXN3 si RNA组细胞融合率如下,在SK-N-AS细胞中,45.4%vs 71.8%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,38.2%vs61.8%,P值<0.01;在顺铂处理的条件下:ATXN3 si RNA联合Bcl-xl si RNA组细胞融合率vs ATXN3 si RNA组细胞融合率如下,在SK-N-AS细胞中,38.9%vs 57.7%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,40.9%vs 61.0%,P值<0.01。（2）利用CCK8对细胞活性进行检测结果显示:在依托泊苷和顺铂处理的条件下,与单独下调ATXN3组相比较,联合下调ATXN3和Bcl-xl的表达组的细胞存活率显著降低。ATXN3 si RNA联合Bcl-xl si RNA组vs ATXN3 si RNA组细胞存活率如下:在依托泊苷处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,51.5%vs 68.0%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,50.6%vs 65.3%,P值<0.01;在顺铂处理的条件下:在SK-N-AS细胞中,45.6%vs 60.7%,P值<0.01;在SK-N-BE2细胞中,51.2%vs 71.7%,P值<0.01。结论:1.ATXN3是NB患者一个独立预后影响因素。2.下调ATXN3的表达水平增强NB细胞对AKT抑制剂（Perifosine和MK-2206）的敏感性。3.BIM部分介导了因ATXN3表达水平降低引起的NB细胞对AKT抑制剂敏感性增加的过程。4.与AKT抑制剂作用不同,下调ATXN3的表达水平不但没有增强,反而降低NB细胞对依托泊苷和顺铂的敏感性,抑制了依托泊苷和顺铂引起NB细胞的死亡。5.Bcl-xl部分介导了因ATXN3表达水平降低引起的NB细胞对化疗药物（依托泊苷和顺铂的）敏感性减弱的过程。本研究为临床上NB患者的治疗方案的选择以及精准用药,改善患者治疗效果,提供重要理论指导。