【摘 要】
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氟化反应是化学家梦寐以求的五个反应之一,超过20%的商业药品中都含有氟,尽管含氟化合物在药物开发中的重要性日益增加,但在一般或特定的位置直接将C-H键转变为C-F键仍然是一项极具挑战性的工作。相比于化学合成,酶催化的方法效率更高。细胞色素P450单加氧酶是可以将氧直接插入C-H键的天然催化剂,科学家们发现利用P450突变体可以催化多种非天然的反应,本课题将研究P450的突变体P411CHA催化C-
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氟化反应是化学家梦寐以求的五个反应之一,超过20%的商业药品中都含有氟,尽管含氟化合物在药物开发中的重要性日益增加,但在一般或特定的位置直接将C-H键转变为C-F键仍然是一项极具挑战性的工作。相比于化学合成,酶催化的方法效率更高。细胞色素P450单加氧酶是可以将氧直接插入C-H键的天然催化剂,科学家们发现利用P450突变体可以催化多种非天然的反应,本课题将研究P450的突变体P411CHA催化C-H键转变为C-F键的氟化反应。成功克隆表达了P411CHA酶,将包含P411CHA基因的质粒转化到大肠杆菌中,利用IPTG和5-ALA进行诱导表达,通过SDS-PAGE凝胶电泳证明了蛋白可溶且分子量大小约为116 k Da,利用吡啶血红素法测定了细胞裂解液中的血红素蛋白浓度。合成制备了一系列氟代产物标准品。利用P411CHA与不同的底物进行酶催化反应,氟源为NFSI和Selectfluor,并通过薄层层析色谱初筛和高效液相色谱复筛,成功筛选到三个底物:乙基苯、异丁基苯和β-溴代苯乙烷,初步证明P411CHA具有催化氟化反应的能力。为进一步提高P411CHA的催化活性,对其进行定点突变。以P411CHA酶（PDB:5UCW）构建三维蛋白结构,通过计算机模拟,发现Leu437位可能是底物进入P411CHA血红素活性中心的入口,尝试将Leu437突变为分子量更小的氨基酸;将底物乙基苯对接到P411CHA分子中,发现Val328位氨基酸与与底物的距离为4.0（?）,且与血红素辅因子相邻,对Val328位氨基酸进行饱和突变。利用突变体进行酶催化反应,但酶的催化活性没有明显提高。综合分析实验结果,本课题初步确定P411CHA具有催化氟代反应的能力,这为氟化反应的发生提供了一个新的思路和方法。这也是第一次利用细胞色素P450突变体催化化合物的氟化,也为以后的生物催化氟代开辟新的道路。
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