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目的:鲫（Carassius auratus）是我国重要的淡水养殖鱼类,因其肉质细嫩,味道鲜美而深受消费者青睐。但是,近年来由鲤疱疹病毒Ⅱ型（cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2）引发的鳃出血病给鲫养殖业带来了巨大的经济损失。CyHV-2是异样疱疹病毒科、鲤科疱疹病毒属家族的一种双链DNA病毒,该病毒对金鱼、鲫和异育银鲫等鱼类具有极高的致死率。至目前,仍缺乏针对CyHV-2有效防治手段。文献显示,卵黄抗体能降低弧菌、嗜水气单胞菌及副溶血弧菌的感染,在弧菌病、败血症及急性肝胰腺坏死症的治疗上效果明显。本研究以CyHV-2衣壳蛋白和囊膜蛋白的重组蛋白为免疫原制备具有特异性的卵黄抗体,并通过体内及体外实验对该卵黄抗体进行功能性验证。此外,初步探究了卵黄抗体的保护机制,旨在为治疗CyHV-2引起的鳃出血病提供一种新手段。方法:（1）利用pET-28a（+）表达载体和大肠杆菌原核表达系统诱导表达重组的鲤疱疹病毒Ⅱ型的衣壳蛋白和囊膜蛋白（CyHV-2D4ORFs）,并采用Western blot进行验证。（2）以分离纯化后的重组的D4ORFs蛋白为免疫原,制备抗CyHV-2的卵黄抗体（anti-CyHV-2 IgY）,采用ELISA方法检测该抗体的效价,Western blot验证抗体的特异性。采用ELISA方法评估不同加工工艺制备的卵黄抗体蛋粉中anti-CyHV-2 IgY的效价;筛选出最优的卵黄抗体加工方式。（3）以1 g/mL的抗CyHV-2卵黄抗体溶液为原液,利用M199细胞培养基将抗体原液稀释100倍、200倍,与CyHV-2病毒液混合后孵育鲫鱼的脑细胞（GiCB）进行抗体中和实验,25℃下培养4-14 d观察到细胞病变效应（cytopathic effect,CPE）。将卵黄抗体粉按饲料重量的0.1%、0.3%、0.6%制备功能性饲料,16±2℃水温条件下投喂异育银鲫25 d后以浓度为1.8×105 copies/mL的CyHV-2浸泡感染实验鱼24 h,浸泡病毒后连续观察21 d,统计分析各实验组的相对免疫保护率（relative percent survival,RPS）;采用透射电镜观察CyHV-2病毒粒子的形态特征;伊红-苏木精（hematoxylin-eosin,HE）染色技术用于组织结构损伤判定;实时荧光定量PCR（quantitative PCR,qPCR）用于检测CyHV-2载量的差异,从而筛选出预防效果最佳的卵黄抗体的添加剂量。（4）16±2℃水温条件下,以浓度为1.8 ×105 copies/mL的CyHV-2浸泡异育银鲫感染24 h,随后投喂预防效果最佳的含抗CyHV-2卵黄抗体的功能饲料进行治疗实验;同样观察21 d,统计分析各实验组的RPS。取濒死的异育银鲫体肾,利用qPCR检测病毒载量差异及CyHV-2免疫相关基因的相对表达量;采用HE染色观察鱼的体肾及脾脏组织病理损伤。感染21 d后,采取活鱼的血液进行血清生化指标及血常规指标的检测,评估抗CyHV-2卵黄抗体的治疗效果。结果:成功构建了 pET28a-D4ORFs重组质粒,并诱导出D4ORFs重组蛋白。制备出特异性的抗CyHV-2卵黄抗体,筛选出包膜后冷冻干燥为最优的加工方式。体外病毒中和实验结果显示,在感染CyHV-2病毒9 d时,稀释100倍的卵黄抗体组的GiCB细胞无明显的CPE现象,稀释200倍的卵黄抗体组的GiCB细胞出现少量的细胞孔洞,而接入CyHV-2病毒液的空白对照组及普通蛋粉的阴性对照组的GiCB细胞上出现明显的CPE现象。预防实验结果显示,与只感染病毒的空白对照组相比,普通蛋粉组（阴性对照）及卵黄抗体添加量为饲料重量的0.1%、0.3%、0.6%的处理组的免疫保护力分别为 4.8±8.2%（p＞0.05）、51.8±10%（p＜0.001）、57.9±8.4%（p＜0.001）及75.8±9.5%（p＜0.001）,其中预防效果最佳的为抗体添加量0.6%的处理组。人工感染病毒后的异育银鲫体肾中CyHV-2载量随着卵黄抗体添加量的增加逐渐降低（p＜0.05）,而且濒死的异育银鲫体肾中CyHV-2载量高于存活的异育银鲫（p＜0.05）;这一结果与透射电子显微镜下观察到的各处理组内CyHV-2病毒粒子密度结果相一致。相较于正常鱼,攻毒后各实验组的脾脏以及体肾均出现了不同程度的损伤,其中卵黄抗体添加量为0.6%的鱼脾脏、体肾病理损伤较小,与正常组相近。治疗实验结果表明,阴性对照组（拌普通蛋粉）及卵黄抗体组的免疫保护力分别为 7.7±7.7%（p＞0.05）及 80±11.5%（p＜0.001）。qPCR 检测结果发现,空白（只饲喂商品饲料）及阴性对照组中的濒死的鱼及活鱼体肾内CyHV-2载量无差异（p＞0.05）,卵黄抗体组活鱼的病毒载量最低（p＜0.05）。组织病理切片结果显示,卵黄抗体组的脾脏、肾脏细胞结构完整,而阴性对照组和空白对照组的脾脏及肾脏在感染CyHV-2后受损伤严重,出现组织坏死及空泡化等病理现象。血清生化指标检测结果显示,相较于正常鱼,空白对照组及阴性对照组的鱼肝功能相关酶活性谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）及碱性磷酸酶（ALP）显著升高（p＜0.05）,而卵黄抗体组的AST、ALT及ALP活性无显著升高（p＞0.05）;空白对照组、阴性对照组及卵黄抗体组的白蛋白（ALB）含量均显著性增加（p＜0.05）,其中卵黄抗体组ALB的增加量显著低于空白对照组及阴性对照组（p＜0.05）,说明卵黄抗体组的鱼肝受损伤程度较小。与正常鱼相比,攻毒处理后空白对照组及阴性对照组的红细胞计数、红细胞压积、血红蛋白含量、平均血红蛋白浓度、平均血小板体积、中性粒细胞数目及百分比等指标显著下降（p＜0.05）;嗜碱性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞数目、白细胞数目及淋巴细胞数目显著上升（p＜0.05）;血小板计数、单核细胞数目无明显变化（p＞0.05）。而卵黄抗体组与正常鱼相比,红细胞压积、平均血红蛋白浓度、中性粒细胞计数及百分比显著下降（p＜0.05）,但下降幅度显著小于空白及阴性对照组（p＜0.05）;嗜碱性粒细胞百分比、嗜碱性粒细胞数目及淋巴细胞百分比显著上升（p＜0.05）,但上升幅度显著低于空白及阴性对照组（p＜0.05）;其它血常规指标无显著变化无显著变化（p＞0.05）,这说明异育银鲫受CyHV-2感染后采用卵黄抗体治疗后会减轻出血程度,只出现较轻的病症。qPCR结果显示,攻毒后各实验组所有濒死的异育银鲫鱼体肾中免疫基因白介素 11（interleukin 11,IL-11）、白介素 6（interleukin 6,IL-6）、补体 C3（the third complement component,C3）、嘌呤核苷磷酸化酶（Purine nucleoside phosphorylase 5a,Pnp5a）、Ⅰ 型干扰素（interferon c,IFNc）及凝集素（Intelectin,ITLN）出现表达量上调的现象,而饲喂卵黄抗体组上调不显著（p＞0.05）,说明卵黄抗体能够抗CyHV-2感染,提高鱼体免疫力。攻毒21 d后各处理组存活的异育银鲫免疫相关基因变化的规律不一致:相较于正常组,空白对照组、阴性对照组及卵黄抗体组IL-11及Pnp5a的相对表达量均显著性上调（p＜0.05）,其中卵黄抗体组的上调倍数最高;空白对照组与卵黄抗体组鱼的IFNc相对表达量比正常鱼上调1.3倍（p＞0.05）及8.6倍（p＜0.05）,阴性对照组下调16.5倍（p＜0.05）。空白对照组、阴性对照组、卵黄抗体组存活的异育银鲫IL-6的相对表达量均显著下调（p＜0.05）,其中卵黄抗体组的下调倍数最低（p＜0.05）;空白对照组、阴性对照组则与正常鱼的C3相对表达量无差异（p＞0.05）,卵黄抗体组上调21.7倍（p＜0.05）。三组ITLN相对表达量均显著性下调（p＜0.05）,但三组之间无显著性差异（p＞0.05）,推测卵黄抗体组存活的异育银鲫本身体质较弱。结论:本研究成功诱导表达了D4ORFs重组蛋白,制备了抗CyHV-2卵黄抗体,并确定包膜后冷冻干燥为最优的卵黄抗体加工方式。体外抗体中和实验证实,抗该卵黄抗体可有效降低CyHV-2对GiCB细胞感染程度。添加0.6%剂量的卵黄抗体能有效预防异育银鲫鳃出血病的发生;口服0.6%卵黄抗体剂量的饲料能显著提高感染CyHV-2后的异育银鲫存活率。CyHV-2载量分析显示,抗CyHV-2卵黄抗体能够降低进入鱼体内CyHV-2病毒粒子数量;免疫相关基因的相对表达水平、血液及血清指标、HE组织病理损伤结果均显示抗CyHV-2卵黄抗体能够降低鱼体内的组织损伤及免疫反应起到保护作用。