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枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）隶属蔷薇科（Rosaceae）苹果亚科（Maloideae）枇杷属,为亚热带木本果树。枇杷在资源评价、创新、利用等方面已取得很多成就,但高效再生体系和遗传转化体系缺乏限制了其分子育种的进程。外源生长素和细胞分裂素是植物愈伤组织保持阶段重要的添加剂,筛选枇杷愈伤组织增殖阶段适宜的外源生长素和细胞分裂素浓度是建立枇杷组培再生体系的必要环节之一。同时,开展愈伤组织增殖阶段相关调控因子的分子功能分析能为枇杷愈伤组织增殖体系优化提供理论依据。本研究以枇杷不同基因型不同发育时期合子胚为外植体,利用不同培养基进行愈伤组织诱导,并对愈伤组织进行胚性鉴定。选取‘金华2号’枇杷胚性细胞系分别进行不同浓度生长素NAA（N1～N3）和细胞分裂素TDZ（T1～T3）处理,检测其第7 d、14 d、21 d、28 d愈伤组织增殖系数,同时利用实时荧光定量方法检测了细胞增殖相关调控因子EjCLE25、Ej SERK1、Ej LEC2、Ej CUC1在N1～N3、T1～T3处理不同时间的表达量。同时,以‘金华2号’胚性愈伤为材料,克隆了关键调控因子EjCLE25基因,并对其进行了基因特征及分子功能分析,该研究为解释EjCLE25参与调控枇杷胚性愈伤组织增殖的分子机制提供了基础。主要试验结果如下:1.枇杷合子胚愈伤组织诱导（1）不同基因型不同发育时期合子胚为外植体诱导愈伤组织,枇杷未成熟子叶胚的愈伤诱导率较高,最高达80.56±16.43%,是枇杷最佳合子胚愈伤组织诱导外植体。（2）方案A中,最适培养基为:1/2MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.25 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+250 mg·L-1酸水解酪素,诱导率最高达82.22±8.89%;方案B中,最佳培养基为:B5+1.0 mg·L-1IBA+1.0 mg·L-1NAA+1.5 mg·L-1TDZ+15 g·L-1蔗糖,诱导率最高达46.67±26.67%,且NAA和TDZ分别对愈伤组织诱导有显著促进作用。（3）诱导方案A培养28d后,白肉枇杷‘华白1号’枇杷愈伤组织诱导率最高达50.00±5.56%;红肉枇杷‘金华2号’愈伤组织诱导率最高为66.67±9.07%;野生枇杷诱导率最高的是‘贵野2号’,诱导率高达81.48±5.24%。其中,‘金华2号’愈伤组织在继代增殖培养获取大量黄色颗粒状的胚性愈伤组织,是枇杷最适合子胚组织培养基因型。（4）合子胚愈伤组织可分为3种类型:Ⅰ型:浅黄白色结实粗颗粒块状,生长旺盛,愈伤组织不易与外植体分离;Ⅱ型:透明细砂颗粒状,松软,略水渍化,较难保存培养;Ⅲ型:乳黄白色,细颗粒状,继代增殖培养生长速度较快,且可慢慢变为黄色颗粒愈伤。愈伤组织观察发现,Ⅰ/Ⅱ型愈伤组织细胞体积较大、形状不规则、染色浅、部分细胞出现破碎现象,多为非胚性愈伤;Ⅲ型愈伤组织细胞体积较小、排列紧密且有规则、具有浓厚的细胞质、细胞核较大、染色较深,多为胚性愈伤。2.外源生长素和细胞分裂素对胚性愈伤组织增殖及相关调控因子表达量的影响（1）不同浓度外源激素NAA培养下,‘金华2号’胚性愈伤组织增殖系数变化曲线均呈“S”形,但0.5 mg·L-1NAA增殖效果最好,从第7 d起愈伤增殖速度明显升高,培养至21 d时愈伤增长速度减缓趋于平稳。（2）不同浓度外源激素TDZ处理下,‘金华2号’胚性愈伤组织增殖曲线差异明显,高浓度3.0 mg·L-1增殖系数较低,0.5 mg·L-1和1.5 mg·L-1TDZ愈伤生长呈“S”形,在1.5 mg·L-1TDZ处理下增殖效果最好,继代培养第7 d胚性愈伤增殖开始明显升高。（3）调控因子EjCLE25、Ej SERK1、Ej LEC2、Ej CUC1在愈伤增殖生长最适NAA浓度即0.5mg·L-1时,随着继代培养时间的延长,表达量呈先上升后下降的趋势,在继代培养第7 d表达量最高。进一步分析不同浓度NAA处理下增殖初期和末期时的表达量,发现NAA浓度为0.5mg·L-1时均显著高于其它浓度。（4）调控因子在最适TDZ浓度即1.5mg·L-1时,随着继代培养时间的延长,表达量呈先上升后下降的趋势,在继代培养第7 d表达量最高。T1～T3处理下,在适宜生长的低TDZ浓度下有较高表达,在抑制愈伤增殖的高TDZ浓度下表达量较低。3.EjCLE25基因的序列特征和分子功能分析（1）通过同源克隆技术从枇杷愈伤组织中分离出EjCLE25基因,其CDS全长为291 bp,编码96个氨基酸,在C端具有一个保守的CLE motif。通过进化树分析,EjCLE25与杂交梨（Pyrus ussuriensis x Pyrus communis）CLE25、扁桃Py CLE25、李Pa CLE25等蛋白质同源性较高,聚为同一分支。（2）构建了35S::EjCLE25超表达载体,观察发现35S::EjCLE25超表达拟南芥延缓愈伤组织增殖培养过程褐化现象,延迟开花10～15天,且会显著抑制其根的生长,上述结果表明EjCLE25具有抑制花芽分化和根尖分生组织活性的功能,推测EjCLE25有利于枇杷胚性愈伤的保持和增殖。