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植物囊泡样纳米颗粒（P-VLNs）是具有双层膜结构的微小囊泡,内含生物活性脂质、蛋白质、RNA等成分。细胞外囊泡（Extracellular vesicles,EVs）是由细胞分泌的具有膜结构的一类囊泡,已被认为是细胞间通讯的主要机制之一。近年来,许多研究者在植物类中药中发现囊泡样纳米颗粒（vesicle-like nanoparticles,VLNs）的存在,并且发现VLNs具有多种生物活性,如蒲公英、红景天VLNs具有抗炎作用,能够抑制IL6,TNF等炎症因子的产生;生姜VLNs在抑制分泌蛋白血凝素的表达中起着重要作用,并影响其他线粒体和细胞质蛋白的表达,如热休克蛋白、轴突和运动蛋白,以促进肠道伤口愈合。这些研究为中药新活性成分的研究提供了新的切入点。中药黄芪VLNs是否具有药理活性,目前尚无相关的研究报道。为此,本实验对黄芪水煎液中VLNs的提取方法、成分组成、体内分布及药效学等方面进行了初步研究。目的:1)确定从黄芪水煎液中提取囊泡样纳米颗粒可行性及方法。2)初步探讨黄芪VLNs的药效及其作用机制。方法:1.黄芪VLNs提取方法的建立采用超速离心法和尺寸排阻色谱法对黄芪水煎液中的囊泡样纳米颗粒的提取进行比较;使用透射电子显微镜、纳米粒径追踪分析仪对黄芪VLNs进行表征鉴定,对比分析适合黄芪VLNs的提取方法。2.黄芪VLNs的成分分析使用液相-质谱法分析黄芪VLNs中的化学成分、脂质成分,使用测序技术检测 microRNA。3.黄芪VLNs 口服途径的体内分布①黄芪VLNs在正常小鼠体内分布:雄性ICR小鼠根据体质量随机分为DIR-VLNs组3只,DIR组1只,分别口服DIR-VLNs和DIR后,动态观察1h,3h,4h,6h小鼠体内黄芪VLNs的分布变化。②黄芪VLNs在糖尿病小鼠体内分布:雄性db/db小鼠根据体质量随机分为DIR-VLNs组3只,DIR组1只,分别口服DIR-VLNs和DIR后,动态观察1h,3h,4h,6h小鼠体内黄芪VLNs的分布变化。4.黄芪VLNs miRNA治疗气虚证的网络药理学研究通过生信分析筛选出黄芪VLNs miRNAs的相关靶点,利用SymMap数据库检索气虚证症状相应现代医学症状（MM症状）并通过Genecards数据库搜索其相关基因,取气虚证排名前100的基因与黄芪VLNs的相关靶点的交集,初步确定为黄芪VLNs治疗气虚证的潜在靶点。利用STRING数据库构建潜在靶点蛋白互作PPI网络,并通过Cytoscape3.7.2软件获取核心靶点;KOBAS和Metascape数据库对核心靶点进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析,进而预测黄芪VLNs治疗气虚证的关键靶点和通路。5.黄芪VLNs的药效学初步研究①雄性ICR小鼠根据体质量随机分为正常组10只,模型组38只。模型组小鼠进行睡眠剥夺一周后,根据抓力将模型组分为黄芪VLNs组12只（10.6 g·kg-1）,黄芪水煎液组13只（10.6 g·kg-1）和模型组13只。正常组和模型组按照10 mL·kg-1灌胃PBS,每天1次,连续给药5周。实验结束后,检测小鼠的抓力、脉搏、脏器指数等相关证候指标以及肠道菌群多样性。②雄性db/db糖尿病小鼠,按血糖值随机分为模型组,黄芪VLNs高、中、低剂量（21.1,10.6,5.3 g·kg-1）组和二甲双胍组（0.25 g·kg-1）,每组 7 只,另设7只C57BL/6小鼠作为正常组,灌胃给药3周（每日1次）,每周观察小鼠空腹血糖变化;苏木素-伊红（HE）染色观察糖尿病小鼠肝脏和胰腺病理形态情况;采集小鼠粪便进行肠道微生物16S rRNA多样性检测。结果:1黄芪VLNs提取方法的建立超速离心法获得的黄芪VLNs电镜下呈典型茶托状或凹陷的半球状,背景干净;尺寸排阻色谱法提取的黄芪VLNs形态较差,囊泡有所损坏,背景相对干净。超速离心法得到的黄芪VLNs粒径相对较小;分布较集中,原始浓度为3.0×1011个/mL。粒径峰值165.8 nm,峰面积占比95.2%。平均粒径大小172.4 nm,主要在100-300 nm之间分布。尺寸排阻色谱法获得的黄芪VLNs粒径相对较大·;粒径范围较宽,原始浓度为2.2×1011个/mL。粒径峰值193.2 nm,峰面积占比90.9%。平均粒径大小216.7 nm,大致在70-400 nm之间分布。2黄芪VLNs的表型特征与组成成分2.1黄芪VLNs的表型特征超速离心法获得的黄芪VLNs电镜图显示其有明显的双层膜结构,呈典型茶托状或凹陷的半球状。纳米颗粒追踪分析显示黄芪VLNs原始浓度为4.9×1011个/mL,粒径峰值152.4 nm。实测平均粒径大小195.2 nm,大致在100-300 nm之间分布。Zeta电位分析显示,峰值-21.6 mV,峰面积占比91.5%。2.2黄芪VLNs的组成成分1)黄芪VLNs脂质成分黄芪VLNs脂质化合物化合物主要包括甘油脂类（如TG、DG等）,鞘脂类（如Cer、CerG1等）,甘油磷脂类（如PC、PE等）;其中TG含量占45%,Cer含量占23%,PC含量占8%。2)黄芪 VLNs microRNA（miRNA）组成黄芪VLNs中表达水平为中、高等水平的miRNA共有75种,表达量>50的共有24种,其中表达量最高的miRNA为peu-MIR2916-p32ss18TC19GA,占44%,其次是 peu-MIR2916-p51ss3AG,其表达量占 29%。3 口服黄芪VLNs的体内分布①ICR正常小鼠:给药1h,3h,4h后,可在小鼠腹部看到荧光,6h后荧光消失,提示口服黄芪VLNs主要分布组织为胃肠道。②db/db糖尿病小鼠:给药1h,3h,4h后,可在小鼠腹部看到荧光,6h后1号小鼠腹部仍可见荧光,解剖后在胃肠道处有荧光,提示口服黄芪VLNs主要分布组织为胃肠道。4黄芪VLNs miRNA治疗气虚证的网络药理学研究1)黄芪VLNs miRNA益气作用可能与PI3K-AKT等与信号转导相关通路,以及糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路有关。2)黄芪VLNs治疗气虚证可能通过PIK3CA、PIK3R1、AKT1、STAT3等靶点发挥作用。5黄芪VLNs的药效学初步研究①气虚证模型:与正常组相比,模型组小鼠体质量、抓力、脉搏指数极显著下降（P<0.01）;与模型组相比,VLNs组体质量无明显变化（P>0.05）,抓力、脉搏指数极显著增高（P<0.01）,胸腺指数显著降低（P<0.05）,脾脏指数无明显变化（P>0.05）。肠道菌群结果显示,与模型组相比,VLNs组颤螺菌、Negativibacillus、Alistipes inops含量显著增加（P<0.05）,柠檬酸杆菌、肠杆菌和巨型球菌含量显著降低（P<0.05）。②糖尿病模型:与模型组比较,黄芪VLNs高、中、低剂量组均能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖（P<0.05,P<0.01）;可改善肠道菌群失调,显著降低厚壁菌门/拟杆菌门比例,提高有益菌相对丰度,降低有害菌相对丰度。结论:1从黄芪水煎液中提取黄芪VLNs具有一定可行性,且提取方法适合采用超速离心法;2黄芪VLNs含有多种脂质、miRNAs等成分,且口服黄芪VLNs主要分布于胃肠道,不能直接吸收入血。3黄芪VLNs可以通过调节肠道菌群进而改善气虚证小鼠症状,并有效降低糖尿病小鼠的血糖。