背景:支气管哮喘（bronchial asthma,以下简称哮喘）是当今世界最常见的慢性呼吸道疾病之一,据统计,截至2015年全球约有3.34亿哮喘患者[1]。近年来,儿童哮喘的患病率呈现出逐年攀升的趋势,第三次中国城市儿童哮喘流行病学调查显示,我国城市儿童哮喘患病率已经从十年前的1.97%上升到3.02%,儿童哮喘患病率增幅达到了54.1%[2]。值得注意的是,在我国,大约有1/3的哮喘儿童没有得到及时和明确的诊断,接近半数的儿童哮喘没有得到有效控制,出现肺功能的持续性损害[2]。因此,明确儿童哮喘的发生机制,寻找儿童哮喘的诊断和治疗的靶标意义重大。目前普遍认为,在环境因素刺激下,气道上皮细胞可以通过上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）的形式参与哮喘气道重塑的发生[3,4]。如何调控支气管上皮细胞EMT过程、减轻气道重塑已成为哮喘防治的关注重点。长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸的RNA分子,其广泛存在于真核生物体内,参与细胞内多种过程的调控,但却不能编码蛋白质[5]。与编码蛋白质的m RNA相比,它们的表达丰度一般较低,却具有高度保守的二级结构,以及更强的组织细胞类型特异性[6]。正由于这种特性,lncRNA成为了许多疾病诊断、判断预后的潜在的分子标记物,对于其功能机制的研究,则为疾病的治疗提供了靶点。目前已有研究对成人哮喘患者的全血样本或外周血T淋巴细胞进行测序分析,发现lncRNA在哮喘患者中存在差异表达,提示lncRNA可能从表观遗传角度,参与调控了成人哮喘的免疫、气道炎症等多种病理过程[7-11]。然而,对大多数哮喘相关的lncRNA的功能和临床意义的研究仍然有限。因此,分析lncRNA在儿童哮喘中的差异表达谱,寻找与儿童哮喘发病及疾病进展可能相关的lncRNA,将有可能为儿童哮喘的防治,减缓气道重塑的进程,防止肺功能损害进行性加重提供新的方向及治疗靶点。目的:建立儿童哮喘外周血中差异表达的lncRNAs表达谱及m RNAs表达谱,获得差异表达m RNAs的分子功能、参与的生物学过程及其富集的疾病通路信息。同时筛选并验证目标lncRNA在支气管上皮细胞EMT过程中的生物学功能和潜在的调控机制,为进一步探讨儿童哮喘的发生机制和防治提供理论依据及治疗靶点。研究方法:一、应用lncRNA/m RNA基因芯片获得儿童哮喘外周血中差异表达的lncRNAs表达谱,结合生物信息学分析筛选目标lncRNA,并验证目标lncRNA及其关联的mi RNA和m RNA在儿童哮喘患者外周血中的表达变化。1、收集所有研究对象的静脉血5ml,用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。2、应用Trizol法提取样本总RNA,并进行质量检测。3、选取6例外周血单个核细胞样本（哮喘组和健康对照组各3例）,应用Arraystar Human Lnc RNA Microarray 4.0芯片分析。4、两组样品间具有统计学意义的差异表达Lnc RNAs或差异表达m RNAs通过P-value/FDR筛选。两个样品间差异表达Lnc RNAs或差异表达m RNAs通过Fold Change筛选。差异表达m RNAs进行Pathway和GO的富集分析,使用编写脚本进行层次聚类和关联分析。5、应用生物信息学方法,构建差异表达基因的PPI网络,进一步筛选hub基因。建立差异表达lncRNAs与hub基因的关联性网络图,同时通过mi RWalk数据库寻找hub基因与mi RNA之间的相关基因对,最终将mi RNA-m RNA基因对及lncRNA-mi RNA基因对取交集,获取lncRNA-mi RNA-m RNA基因对,筛选出目标lncRNA。6、应用实时定量反转录聚合酶链式反应（q RT-PCR）技术,扩大样本量,在哮喘患儿和健康对照儿童的外周血样本中验证目标lncRNA及其关联的mi RNA和m RNA的表达情况。二、lncRNA PTTG3P对支气管上皮细胞EMT及其增殖迁移能力的影响1、本课题第一部分的研究最终筛选并确定lncRNA PTTG3P可能在儿童哮喘中发挥重要作用。体外培养人支气管上皮细胞（16HBE细胞）系,建立细胞模型。应用TGF-β1刺激16HBE细胞,显微镜下观察细胞形态,Westen Blot检测E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白及α-SMA蛋白等EMT标志物的表达情况。明确TGF-β1诱导16HBE细胞发生EMT的最佳浓度及最佳作用时间。2、TGF-β1诱导支气管上皮细胞EMT时,应用q RT-PCR检测lncRNA PTTG3P的表达变化情况。3、通过小干扰RNA技术（small interference RNA,si RNA）敲低lncRNA PTTG3P,Westen Blot技术检测E-cadherin蛋白、Vimentin蛋白及α-SMA蛋白等EMT标志物的变化情况并观察细胞形态改变。同时应用CCK-8实验及transwell实验检测支气管上皮细胞的增殖及迁移能力,明确敲低lncRNA PTTG3P对支气管上皮细胞EMT及其增殖、迁移能力的影响。三、lncRNA PTTG3P在支气管上皮细胞EMT中作用机制的研究1、本课题第一部分的研究最终筛选并确定lncRNA PTTG3P可能在儿童哮喘中发挥重要作用,同时结合生物信息学分析及q RT-PCR的大样本验证,发现mi R-192-3p及CCNB1在儿童哮喘中也存在差异表达,其可能成为受lncRNA PTTG3P调控的下游作用因子,于是在TGF-β1诱导的支气管上皮细胞EMT的体外模型中采用q RT-PCR及Westen Blot方法分别检测其表达水平。2、通过si RNA技术敲低lncRNA PTTG3P,q RT-PCR及Western Blot方法分别检测mi R-192-3p及CCNB1的表达水平,明确lncRNA PTTG3P对mi R-192-3p及CCNB1表达的影响。3、过表达mi R-192-3p,应用Westen Blot方法检测16HBE细胞中E-cadherin蛋白、α-SMA蛋白及Vimentin蛋白的变化情况并观察细胞形态变化,明确mi R-192-3p对支气管上皮细胞EMT的调控作用。4、过表达mi R-192-3p,应用Westen Blot及q RT-PCR方法检测CCNB1的表达水平,明确mi R-192-3p对CCNB1的调控作用。5、采用双荧光素酶报告基因检测实验证明mi R-192-3p与lncRNA PTTG3P及CCNB1的直接结合。6、通过敲低lncRNA PTTG3P同时低表达mi R-192-3p的挽救实验,来验证敲低lncRNA PTTG3P促进支气管上皮细胞EMT的作用可以被低表达mi R-192-3p所拮抗,进一步证明lncRNA PTTG3P可能通过吸附mi R-192-3p,上调CCNB1,进而促进支气管上皮细胞EMT的作用机制。研究结果:一、儿童哮喘外周血中存在特异的lncRNAs表达谱,lncRNA PTTG3P在儿童哮喘患者外周血中高表达,mi R-192-3p在儿童哮喘患者外周血中低表达,CCNB1在儿童哮喘患者外周血中高表达。1、筛选得到差异表达的1nc RNAs共397个,其中193个lncRNAs表达上调,204个lncRNAs表达下调。筛选得到差异表达的m RNAs共477个,其中398个m RNAs表达上调,79个m RNAs表达下调。2、差异表达基因的GO分析提示,差异表达的m RNAs在“细胞周期”、“与蛋白质结合”等出现富集;Pathway分析提示,差异表达的m RNAs在细胞周期、免疫调节、p53等相关信号通路富集。3、基因芯片和q RT-PCR方法双重证实lncRNA PTTG3P在儿童哮喘患者外周血中的高表达,通过生物信息学分析,进一步发现与mi R-192-3p和CCNB1可能与PTTG3P相关联。4、q RT-PCR验证mi R-192-3p在哮喘组中的表达下调（p=0.024）,而CCNB1在哮喘组中的表达上调,差异具有显著性（p<0.0001）。二、在体外TGF-β1诱导16HBE细胞的EMT模型中,敲低lncRNA PTTG3P抑制EMT过程,抑制16HBE细胞的增殖和迁移能力。1、予不同浓度TGF-β1处理16HBE细胞48小时,细胞中E-cadherin蛋白表达水平随TGF-β1浓度升高而逐渐下降（p<0.01）,Vimentin和α-SMA蛋白表达水平逐渐升高（p<0.01）;予10ng/ml TGF-β1处理16HBE细胞不同时间后,细胞中E-cadherin蛋白表达水平随TGF-β1作用时间延长而逐渐下降（p<0.01）,Vimentin和α-SMA蛋白表达水平逐渐升高（p<0.01）;从而筛选出TGF-β1最佳浓度为10ng/ml及最佳作用时间为48小时。予10ng/ml TGF-β1处理16HBE细胞24小时后,细胞形态即由圆形或多边形、铺路石样,变为长梭形,细胞间隙增宽,出现EMT改变。2、予10ng/ml TGF-β1处理细胞48小时后,16HBE细胞中lncRNA PTTG3P表达显著上调（p<0.05）。3、通过si RNA技术筛选出敲低效率最高的si-PTTG3P-362,可显著下调lncRNA PTTG3P的表达（p<0.005）。敲低PTTG3P可以上调上皮标志物E-cadherin蛋白表达（p<0.05）,下调间质细胞标志物Vimentin和α-SMA蛋白表达（p<0.05）。此外,敲低lncRNA PTTG3P还有助于维持细胞上皮样形态。4、CCK-8实验及transwell实验结果显示,敲低lncRNA PTTG3P可抑制16HBE细胞的增殖和迁移能力（p<0.05）。三、在体外TGF-β1诱导16HBE细胞的EMT模型中,过表达mi R-192-3p下调CCNB1的表达,抑制EMT过程;低表达mi R-192-3p可以拮抗敲低lncRNA PTTG3P对EMT的抑制作用及CCNB1蛋白表达的影响。1、TGF-β1诱导16HBE细胞的EMT模型中,mi R-192-3p表达量随时间延长而逐渐减少（p<0.05）;CCNB1表达量随时间延长而逐渐增加（p<0.05）。2、在TGF-β1诱导的16HBE细胞模型中,敲低lncRNA PTTG3P可下调CCNB1蛋白及m RNA的表达（p<0.05）,同时上调mi R-192-3p的表达（p<0.01）。3、在TGF-β1诱导的16HBE细胞模型中,过表达mi R-192-3p可以上调上皮标志物E-cadherin蛋白的表达（p<0.01）,下调间质标志物Vimentin和α-SMA蛋白的表达（p<0.01）。且过表达mi R-192-3p还有助于16HBE细胞上皮样形态的维持。4、在TGF-β1诱导的16HBE细胞中,过表达mi R-192-3p可下调CCNB1蛋白和m RNA的表达（p<0.05）。5、双荧光素酶报告基因检测结果显示,mi R-192-3p可显著下调p SI-check2-PTTG3P及p SI-check2-CCNB1-3’UTR荧光素酶活性（p<0.05）;而在p SI-check2-PTTG3P-mut及p SI-check2-CCNB1-3’UTR-mut组二者荧光素酶活性无差异。提示mi R-192-3p可以与lncRNA PTTG3P及CCNB1的3’UTR端直接结合。6、与单独转染si-PTTG3P组相比,同时转染si-PTTG3P和mi R-192-3p inhibitor组中E-cadherin蛋白表达减少（p<0.05）,Vimentin,α-SMA及CCNB1蛋白表达增加（p<0.05）,提示低表达mi R-192-3p可以拮抗敲低lncRNA PTTG3P对TGF-β1诱导的16HBE细胞EMT及CCNB1蛋白表达的影响,说明lncRNA PTTG3P促进TGF-β1诱导的16HBE细胞发生EMT,可能是通过对mi R-192-3p及CCNB1的调控而实现的。研究结论:1、lncRNA/m RNA基因芯片筛选得到lncRNA PTTG3P在儿童哮喘患者外周血中高表达,与lncRNA PTTG3P相关的CCNB1 m RNA在儿童哮喘患者外周血中同样高表达。2、基于lncRNA PTTG3P和CCNB1 m RNA的生物信息学分析筛选得到mi R-192-3p,mi R-192-3p在儿童哮喘患者外周血中低表达。3、TGF-β1诱导支气管上皮细胞可发生EMT改变,并且TGF-β1诱导支气管上皮细胞发生EMT时,lncRNA PTTG3P的表达上调。4、lncRNA PTTG3P能够促进TGF-β1诱导的支气管上皮细胞EMT过程,并且能够增强支气管上皮细胞的增殖和迁移能力。5、TGF-β1诱导支气管上皮细胞发生EMT时,mi R-192-3p的表达下调;mi R-192-3p能够靶向调控CCNB1,抑制TGF-β1诱导的支气管上皮细胞EMT过程。6、lncRNA PTTG3P作为ce RNA,通过与mi R-192-3p竞争性结合,从而靶向调控CCNB1,进一步促进支气管上皮细胞EMT,参与哮喘的发生发展过程。