【摘 要】
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目的：
辣椒素受体(vanilloid receptor type1,VR1)是近年来被克隆的一疼痛感受器,其是否参与癌痛的发生机制,相关研究还很少。RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)是近几
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目的：
辣椒素受体(vanilloid receptor type1,VR1)是近年来被克隆的一疼痛感受器,其是否参与癌痛的发生机制,相关研究还很少。RNA干扰技术(RNAinterference,RNAi)是近几年新兴的基因阻断技术。它通过外源性或内源性双链RNA触发同源性mRNA的降解,可以特异性地沉默目的基因。本实验首先采用RNA干扰技术构建靶向VR1受体siRNA,然后鞘内注射入癌痛模型鼠,观察其对脊髓背角VR1受体mRNA的效应及镇痛作用,以期揭示VR1在癌痛发生机制中的作用。
方法：
1.根据siRNA设计原则,参照VR1受体mRNA的序列设计出两个19个碱基的DNA靶区段。合成的发卡DNA,两端连有BamHI和Xho I酶切位点,便于与pRNAT-U6.2/Lenti表达载体重组。发卡DNA经退火、纯化,克隆入siRNA表达载体,以通用引物pRNA-U6.2 Forward、pRNA-U6.2 Reverse进行PCR扩增鉴定。最后进行慢病毒包装及效价测定。
2.观察两个构建好的siRNA实际效应。分别对3只健康的C57BL/6小鼠鞘内给予10μl siRNA,同时设置阴性对照组,12h后取脊髓L4-L6段背角组织,用RT-PCR法验证对VR1的沉默效果。
3.建立癌痛模型及行为学测定。14只健康雄性C57BL/6J小鼠被随机分成2组:tumor组(右后肢移植10μl含2×105个B16BL6细胞,n=7)和sham组(仅注射10μl PBS(pH7.4),n=7)。两组术前连续测量2天双侧后肢机械刺激和热刺激足反射潜伏期；移植肿瘤细胞后第3天开始测量,连续测至第20日。
4.观察VR1-siRNA对癌痛小鼠的效应。21只模型鼠被随机分成3组:实验组(9只给予10μl pRNAT-U6.2/Lenti-siRNA)、空载体组(9只给予10μlpRNAT-U6.2/Lenti-)和3只模型对照组。鞘内注射后6h、12h、24h,检测双侧后肢对机械刺激和热刺激缩足反射潜伏期。之后,分别取不同时间点的脊髓背角L4-L6段组织,用RT-PCR法检测VR1受体mRNA变化情况。
结果：
1.发卡DNA退火结果表明siRNA设计正确。筛选的阳性重组子经测序鉴定证实,目的片段已插入pRNAT-U6.2/Lenti表达载体,经慢病毒包装后分别命名为siRNlA(1)、sirNA(2)。
2.RT-PCR结果显示,对健康小鼠分别给予siRNA(1)、siRNA(2),后者作用更强；我们设计合成的siRNA具有靶向特异性。
3.癌症引起的机械痛觉过敏从移植肿瘤细胞后第6天开始显现；热痛觉过敏则是从移植肿瘤细胞后第7天开始显现,均持续至痛行为观测结束,即移植移植肿瘤细胞后第20天。
4.给予模型鼠siRNA(2)6h、12h后脊髓背角的VR1受体mRNA明显降低,肿瘤引起的疼痛明显缓解；24h后siRNA对VR1受体mRNA作用消失。
结论：
1、成功构建靶向VR1的siRNA慢病毒载体,并且在动物体内证实有效。
2、鞘内注射VR1-siRNA能够减轻癌痛小鼠的机械痛敏和热痛敏；VR1受体参与了癌痛的发生,干预VR1受体可以缓解癌痛。
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