骨骼肌是附着于骨骼上、主要行使运动功能的一类横纹肌。它的周围分布着丰富的血管和淋巴组织。因受神经支配,故又称为“随意肌”。骨骼肌纤维一般具有多个细胞核,在肌纤维和基膜之间有一层肌卫星细胞(muscle satellite cell),该细胞具有修复损伤肌纤维的能力。身体运动主要是通过骨骼肌的收缩完成,运动过程中伴随着糖类分解和能量释放。Daniel Bovet等认为骨骼肌在血糖的利用上具有重要作用。在人体中,绝大多数血糖最终在骨骼肌中完成转化和贮存。患有糖尿病的患者一般都伴随着骨骼肌的衰退萎缩。骨骼肌细胞受损还会引发横纹肌溶解症(rhabdomyolysis,RM),进一步可能导致急性肾功能衰竭(ARF)。因此对骨骼肌的研究有助于了解骨骼肌相关疾病的发病机制。我国日常消费的肉类主要来自于猪,而猪肉的营养和风味主要取决于猪肉中肌肉和脂肪含量。瘦肉率是衡量猪肌肉含量的一个重要标准,并且猪肌肉主要是由骨骼肌构成。猪的骨骼肌主要包括背肌和腿肌。研究猪骨骼肌的生长发育对猪的遗传育种改良具有重要意义。而LncRNA MEG3和H19在猪骨骼肌发育过程中调控和被调控的机制研究甚少,因此本文通过对MEG3基因的核心启动子鉴定、相关miRNA的靶标验证、组织和时空表达谱构建和SNPs分型关联分析以及H19基因的组织和时空表达谱构建和SNPs分型关联分析的研究,为进一步研究LncRNAMEG3和H19基因参与骨骼肌生长发育调控的机制奠定基础。1.MEG3基因核心启动子的鉴定通过克隆长白猪MEG3基因启动子然后对其核心功能区域进行鉴定,预测与MEG3基因启动子结合的转录因子,为阐明其在骨骼肌中被特异性启动转录表达的调控机制奠定基础。以长白猪血液基因组DNA为模板,采用PCR方法获取MEG3基因5’侧翼序列,核酸序列测定结果显示,克隆到的MEG3基因5’侧翼序列与GenBank中记录完全一致。然后与pGL3-Basic载体相连接。在双荧光素酶报告基因检测系统中对其启动子活性进行鉴定。荧光素酶活性分析结果显示在猪PK15与PIEC细胞中其启动子活性较强。使用分别从MEG3基因5’侧翼的5’端逐段缺失得缺失分析法,克隆得到长度不同的截短片段,与pGL3-Basic载体相连接,通过双荧光素酶监测系统确定MEG3基因核心启动子,鉴定其启动子活性。结果显示,同pGL3-Basic的活性相比,自5’端缺失的截短片段的,先上升后下降,-440～+86bp的截短片段启动活性接近最高,而-40～+86bp的截短片段活性几乎没有。提示MEG3的核心启动子区域位于-447～-40bp之间,并且该区域内可能存在核心调控元件。根据生物信息学分析,该区域包含转录因子MyoD、SP1、NFY、USF和E47等序列结合位点。2.MEG3与骨骼肌生长发育相关microRNA的靶标验证通过克隆MEG3部分全长片段,预测并验证与其互作的microRNA。为在转录水平上阐明MEG3如何参与骨骼肌生长发育过程的调控机制奠定了基础。以长白猪骨骼肌细胞RNA为模板,采用RT-PCR与touch-down PCR相结合的方法获得MEG3全长部分序列,核酸序列测定结果显示,克隆到的MEG3部分全长序列与GenBank中记录一致,然后插入psi-Check2载体中。同时通过生物信息学方法,预测得到潜在与MEG3克隆序列相作用的mircoRNA。生物信息学分析结果显示,该区域包含miR1 33a、miR133b和miR378的序列潜在结合位点。然后运用双荧光素酶报告基因检测系统进行靶标验证。荧光素酶活性分析结果表明其在猪PK15与PIEC细胞中miR133a与MEG3序列的作用不显著,而miR133b和miR378与MEG3序列具有较强的结合活性。通过RT-qPCR的方法,检测mircoRNA与MEG3的组织表达谱和时空表达谱,实时定量PCR结果显示,MEG3在长白猪骨骼肌和肾脏组织中高表达,并且在骨骼肌生长发育过程中,集中在胚胎期表达,并在胚胎期60d达到最大值。并对胚胎期两者进行趋势相关分析,结果表明,miR378与MEG3之间在表达趋势上有显著的相关性。提示MEG3可能与miR378具有相互作用的关系。说明miR378是对MEG3具有调控作用的潜在microRNA。3.大白猪MEG3基因序列的克隆及其多态性、单体型与背膘等生长性状的相关性通过克隆大白猪MEG3基因序列并寻找潜在的SNP位点,分析其连锁不平衡的单体型,并和矫正背膘、达100kg矫正日龄和达100kg矫正眼肌面积等与骨骼肌发育相关的生长性状进行相关分析,为进一步的深入研究骨骼肌生长发育提供理论依据。本研究根据已经报道的猪MEG3基因序列,成功克隆获得猪的MEG3基因分段序列,利用DNAStar软件的SeqMan进行序列拼接,最终获得包括2个外显子和1个内含子、共计5234bp的DNA序列。核酸序列测定结果显示,克隆的MEG3基因序列与GenBank中记录基本一致。然后设计引物采用32个猪血混合DNA池的方法分段扩增全长,然后直接测序。在混合池测序图谱中,得到存在双峰的11个潜在SNP位点。通过在NCBI上查找RS号对11个SNP进行标注,发现已知RS号的有8个SNP,包括rs322438324、rs318656749、rs81286029、rs344501106、rs325797437、rs334059356、rs323571592、rs322802425 和 3 个新的 SNP 包括 rs25、rs24、rs23。最终对 297个大白猪进行质谱测序,质谱分析结果表明,除rs24未检测出外,其它位点均成功检出所含基因型。并利用Haploview,GraphPad和R语言将测序结果与矫正背膘、达100kg矫正日龄和达100kg矫正眼肌面积等与骨骼肌发育相关的生长性状进行进行统计关联分析。Haploview 分析显示,只有 rs334059356、rs325797437、rs344501106、rs81286029、rs318656749、rs25、rs322438324共6个位点存在等位基因型;单体型分析结果显示存在3种连锁不平衡的基因型。PCA结果显示,对同一性状而言,相同的基因型趋于聚集在一起。与性状的关联分析结果显示,发现在矫正背膘中,rs318656749TT/CT(p=0.0240<0.05)、rs81286029AA/AG(p=0.0487<0.05)、rs344501106AA/AG(p=0.0471<0.05)之间有显著差异,并在 rs334059356AA/TT(p=0.0085<0.01)之间有极显著差异。只有在达到100kg时矫正日龄中rs325797437AG/GG(p=0.0341<0.05)和 rs334059356AT/AA(p=0.0357<0.05)个体表型之间有显著差异,单体型个体在AAAT纯合子和GAAT/GGGC杂合子(p=0.0301<0.05)、AAAT/GGGC和GAAT/GGGC(p=0.0184<0.05)杂合子之间的矫正日龄存在显著差异。其余SNP的分型和3个单体型之间不存在显著差异。最后利用RNADraw绘制具有表型差异的SNP构成的LncRNAMEG3的二级结构,发现rs325797437的位点变异可能导致其二级结构改变。提示rs325797437可能通过改变MEG3转录本的二级结构发挥生物学效应进而来影响个体表型。4.大白猪H19基因编码区序列的克隆及其多态性、单体型与背膘等生长性状的相关性通过克隆大白猪H19基因编码区序列并寻找潜在的SNP位点,分析其连锁不平衡的单体型,并和矫正背膘、达100kg矫正日龄和达100kg矫正眼肌面积等与骨骼肌发育相关的生长性状进行相关分析,为进一步的深入研究骨骼肌生长发育提供理论依据。本研究根据NCBI的猪H19基因编码区序列,成功克隆获得猪的H19基因编码区分段序列,利用DNAStar软件的SeqMan进行序列拼接,最终获得包括6个外显子和5个内含子、共计3352bp的DNA序列。核酸序列测定结果显示,克隆的H19基因序列与GenBank中记录基本一致。然后设计引物采用32个猪血混合DNA池的方法分段扩增全长,然后进行直接测序,在混合池测序图谱中,得到存在双峰的7个潜在SNP位点。对 7 个 SNP 进行标注,包括 RS15、RS16、RS17、RS18、RS20、RS21、RS22。最终对297个大白猪进行质谱测序,并利用Haploview,GraphPad和R语言将测序结果与矫正背膘、达100kg矫正日龄和达100kg矫正眼肌面积等与骨骼肌发育相关的生长性状进行进行统计分析。Haploview分析显示,7个位点均存在等位基因型;单体型分析结果显示存在3个连锁不平衡的区域。PCA结果显示,对同一性状而言,相同的基因型趋于聚集在一起。与性状的关联分析结果显示,在达到100kg时矫正日龄中rs15TT/CT(p=0.0462<0.05)之间有显著差异,其余SNP的分型之间不存在显著差异。而在达到100kg矫正眼肌面积中,rs20的CC/CT(p=0.0374<0.05)和TT/CT(p=0.0478<0.05)两个分型间均有显著差异,特别是在rs20的CC/TT个体间存在极显著差异(p=0.0093<0.01)。对单体型进行进一步关联分析,发现在RS15和RS16连锁的单体型中,TcCt和CcCt(p=0.0498<0.05)之间的矫正背膘存在显著差异;在RS17和RS18连锁的单体型中,CcTt和CtTg(p=0.0371<0.05)之间的矫正眼肌面积存在显著差异。利用qRT-PCR检测H19在9个组织和骨骼肌生长发育过程中15个时期的表达水平。表达谱分析发现,H19主要在骨骼肌和肾脏中表达并在骨骼肌发育的早期阶段中胚胎期105d表现出特异性高表达。提示H19基因存在与骨骼肌生长发育性状相关的SNP位点并可能是骨骼肌中的差异表达基因。