论文部分内容阅读
背景:糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy,DCM）及其早期能量重构,危害严重,诊治困难,雷公藤红素（Celastrol）,对其是否具有保护作用,国内外研究较少。同时,PET/CT心肌代谢显像,能否发挥诊断和疗效评价作用尚不明确。目的:基于Micro PET/CT心肌代谢显像,联合网络药理学、生物信息学和基础实验验证等方法,实现对DCM早期能量重构的诊断,及Celastrol逆向调控的疗效评价和可能机制的初步探索。方法:在制备DCM大鼠模型的基础上,以普通饲料联合不同剂量（50 vs 500 vs 1000ug/kg/day）Celastrol灌胃为主要干预手段,将实验大鼠分为健康对照组（HC）、低（CL）、中（CM）、高（CH）剂量Celastrol干预组和不做干预（NC）组,以临床症状、血生化、超声心动图及病理学指标等为综合评价方法,在Celastrol干预前后,进行18F-FDG与18F-FTHA micro PET/CT心肌代谢显像,分析各组大鼠心肌能量底物流通率常数Ki值的差异（用Influx表示）,并获取同期血样及实验末心肌组织材料,HE染色及Masson观察心肌形态改变和纤维化程度。同时,运用网络药理学和生物信息学方法,预测Celastrol对DCM能量重构,逆向调控的关键作用靶点和相关通路,并通过蛋白免疫印迹（WB）以及实时荧光定量法（RT-PCR）,对特定通路蛋白,进行验证研究。结果:1各组大鼠基本信息:（1）一般行为和临床症状:与HC组相比,DCM组大鼠,精神、反应、毛色等一般状态较差,饮水、进食、尿量显著增多。干预后,NC组大鼠,以上情况较DCM组无明显改善。CL组,大鼠进食、饮水及尿量不同程度的减少,精神、活动及毛发,均较NC组及干预前DCM组,有不同程度改善。CM及CH组大鼠,出现不同程度腹胀、行动缓慢,并于干预的不同时间点,发生不明原因死亡,解剖可见明显肠胀气、局部肠道与腹壁黏连,心脏、肾脏暗红色病变区,伴胸、腹腔积液。（2）血生化指标:DCM组空腹血糖、游离脂肪酸及血清胰岛素,明显较HC组增高,两组间差异具有统计学意义（P＜0.05）。干预后,NC组空腹血糖、甘油三酯、游离脂肪酸及血清胰岛素,较干预前DCM组均增高,但除血清胰岛素外,差异无统计学差异（P＞0.05）。CL组,甘油三酯、游离脂肪酸及血清胰岛素,较NC组及干预前DCM组不同程度减低,与NC组差异有统计学意义（P＜0.05）,与干预前DCM组差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）体重和心脏重量变化:（1）各组大鼠体重:DCM组,体重均高于HC组,差异有统计学意义（P＜0.05）。干预后,CL组和NC组,体重均低于HC组,差异有统计学意义（P＜0.05）,但CL组与NC组间,差异无统计学意义,p大于0.05。（2）各组大鼠心脏重量和心脏指数:各组大鼠心脏重量及心脏指数,差异无统计学意义,P均大于0.05。2 micro PET/CT心肌葡萄糖与脂肪酸代谢显像:与HC组相比,DCM组心肌葡萄糖代谢Influx明显减低,脂肪酸代谢Influx明显增高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。干预后,NC组较干预前DCM组,葡萄糖代谢Influx增高,差异有统计学意义（P＜0.05）,脂肪酸代谢Influx增高,但差异无统计学意义（P＞0.05）。CL组较干预前DCM组,葡萄糖代谢Influx增高,脂肪酸代谢Influx减低,差异均有统计学意义（P＜0.05）;与NC组间相比,脂肪酸代谢Influx减低,差异有统计学意义（P＜0.05）,葡萄糖代谢Influx增高,差异无统计学意义（P＞0.05）。3大鼠超声心动图检查:DCM组较HC组大鼠,LVIDs增加,EF及FS减低,两组具有统计学差异（P＜0.05）。干预后,NC组,LVIDs、EF及FS,与干预前DCM组比较,差异均无统计学意义（P＞0.05）。CL组,与NC组及干预前DCM组间,各指标差异均无统计学意义（P＞0.05）,但描述统计均值结果显示,CL组较NC组,LVIDs减低（4.14±0.31 vs 4.52±0.27）,EF、FS增高（35.80±1.92 vs30.33±6.11;71.20±2.77 vs 63.33±8.08）。4心脏组织病理学分析:（1）DCM组相较于HC组,大鼠心肌纤维排列相对紊乱,伴心肌纤维肿胀和一定程度的心肌纤维化;NC组,相对于干预前DCM组,大鼠心肌细胞间质纤维化未见明显减轻;CL组,相对于NC组及干预前DCM组,心肌细胞排列相对致密有序,未见明显纤维化。（2）各组大鼠心脏Masson染色:心肌细胞呈红色,胶原呈蓝色。HC组大鼠心肌细胞间质及血管周围未见蓝绿色的胶原纤维;干预前DCM组,心肌细胞排列疏松,心肌间质及血管周围存在大量染为蓝绿色的胶原纤维;NC组,相较于干预前DCM组,蓝绿色的胶原纤维未见明显减轻;CL组,相较于NC组及干预前DCM组,心肌细胞排列相对致密,间质胶原明显减轻。5网络药理学和生物信息学预测结果:Celastrol与DCM疾病间,共筛选出IL6、VEGFA、TNF、CASP3、MAPK8 5个关键作用靶点,均可参与调控AGE-RAGE、TNF、MAPK、TOLL样受体、胰岛素抵抗等信号通路,并与脂肪细胞因子、脂肪酸代谢、糖脂生物合成、糖基磷脂酰肌醇生物合成等密切相关。6基础实验验证结果:基于WB法及RT-PCR法均发现,DCM组大鼠心肌组织中P38 MAPK/GAPDHA的比值,较NC组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.01）;CL组,P38 MAPK/GAPDHA相对于DCM组,明显减低,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:1.Celastrol对DCM早期能量重构具有一定的保护作用。50ug/kg/day Celastrol灌胃,纠正DCM模型大鼠心肌能量重构状态的同时,可改善DCM大鼠一般行为、临床症状,及血清糖脂代谢指标异常,并一定程度延缓心脏功能的恶化和心肌间质纤维化。然而,当Celastrol给药剂量≥500ug/kg/day时,可能对DCM大鼠造成严重的毒副作用。2.micro PET/CT心肌糖脂联合代谢显像,能够在DCM早期能量重构的诊断及疗效评价中发挥作用。3.P38 MAPK信号通路异常在DCM早期能量重构中发挥一定作用,且可能为Celastrol发挥作用的有效干预靶点。