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人感染禽流感是由禽流感病毒某些亚型中的一些毒株跨越种属屏障感染人体所致的一种急性呼吸道传染病。自20世纪90年代中后期以来，多个国家和地区相继发生了多次人感染禽流感疫情。2013年3月，我国上海和安徽两省相继报道人感染H7N9亚型禽流感病例，这也是全球首次发现人类感染H7N9禽流感病毒。自2013年以来，我国已发生五波H7N9禽流感疫情，实验室报告确诊病例超过1500人，感染造成多人死亡。研究发现，一些H7N9禽流感病毒已出现基因改变，不仅发生了适应性变化，比其它禽流感病毒更容易感染人类，而且已从低致病性禽流感病毒向高致病性禽流感病毒进化。此外，多起人群聚集性感染事件表明，H7N9禽流感的人传人风险不容忽视，因此，H7N9禽流感已成为人类面临的又一挑战，严重威胁着人类健康。 H7N9禽流感病毒属于RNA病毒，由于RNA依赖的RNA聚合酶纠错功能较差，因此极易发生突变，所以在病毒感染宿主体内存在着大量基因序列有差别但在遗传学上又高度相似的流感病毒混合体，这些病毒混合体被称为准种。病毒准种是一个变异谱系，在选择压力（如药物、免疫和跨物种压力等）下，准种时刻处于动态变化中，可以发生有害、中性或有益突变，而且随着外界压力的选择作用，优势的流感病毒突变株会逐渐被筛选出来，成为该宿主体内流感病毒的优势毒株，准种的存在与进化直接影响到病毒的耐药性、抗原性和致病性等多种生物学特性。本课题重点研究药物选择压力对H7N9禽流感病毒准种演变的影响，为临床抗病毒治疗提供理论基础。目前临床上主要以神经氨酸酶（NA）抑制剂类抗流感药如奥司他韦和帕拉米韦来治疗H7N9禽流感患者，NA抑制剂的药物压力是H7N9病毒的主要选择压力。然而随着NA抑制剂的使用，H7N9病毒已发生耐药变异，直接影响了临床抗病毒治疗的效果。目前所报道的H7N9病毒耐药变异多为从散发的病例中发现，尚未见系统地研究药物选择压力下H7N9病毒准种演变及其意义的相关报道。因此，本研究应用二代测序技术，系统地研究了H7N9禽流感病毒在NA抑制剂帕拉米韦选择压力下的准种演变，并分析了这些演变特别是NA的变异对病毒的耐药性、适应性和致病性等多种生物学特性的影响。 本研究获得如下主要结果： 1.NA抑制剂帕拉米韦选择压力的存在使得H7N9禽流感病毒准种发生了演变，产生了新的优势基因群以A/Nanjing/2/2013(H7N9)毒株作为原始毒株，在MDCK细胞中传代3次使其适应细胞培养，而后将H7N9病毒在MDCK细胞上进行帕拉米韦药物压力下的连续传代。二代测序结果显示，帕拉米韦选择压力的存在使得H7N9病毒在传代过程中基因组范围内更多位点的单核苷酸变异（SNV）增加至高频并趋于稳定，这些位点主要发生于病毒的HA和NA两个基因节段，提示这些变异的基因群在药物选择压力下迅速繁殖演变为病毒准种中的优势基因群。 2.在帕拉米韦选择压力下H7N9病毒NA发生了两个关键氨基酸位点的变异，即I222T和H274Y，药物压力撤除对二者的变异频率无显著影响在观察到NA抑制剂选择压力下H7N9病毒的准种演变之后，我们进一步对病毒NA的变异情况进行了分析。结果发现，到了传代的第12代次，H7N9病毒的NA在帕拉米韦选择压力下发生了两个关键氨基酸位点的变异，即I222T和H274Y，两个位点的变异均始于第10代次，而后频率迅速增加，提示在药物压力环境下二者作为对病毒的有利突变逐渐被筛选出来。进一步研究发现，药物压力的撤除对病毒的I222T和H274Y变异频率无显著影响，说明二者在非药物压力环境下对病毒可能为中性突变。 3.NA的I222T变异降低了H7N9病毒对奥司他韦的敏感性，而H274Y变异使得病毒对奥司他韦和帕拉米韦耐药通过噬斑纯化，我们获得了变异株病毒NA-I222T和NA-H274Y。NA抑制试验结果显示，H7N9病毒NA-I222T毒株对奥司他韦的敏感性显著下降，IC50值与对照组相比增加至8.63倍，而NA-H274Y毒株对奥司他韦和帕拉米韦均表现为耐药，IC50值与对照组相比分别增加至130.15倍和10.18倍。与酶促反应结果一致，在细胞水平，奥司他韦和帕拉米韦对NA-H274Y毒株的生长抑制能力显著下降，对NA-I222T毒株的生长抑制能力轻度减弱，但二者对非NA抑制剂利巴韦林和T-705均表现为敏感。 4.NA的H274Y变异使得H7N9病毒在感染早期复制能力减弱，但并不影响病毒的峰值滴度，这可能与病毒NA活性下降有关为了评估NA的I222T和H274Y变异对H7N9病毒增殖特性的影响，我们观察了两株病毒在MDCK细胞中的复制动力学。结果显示，虽然NA-H274Y毒株在MDCK细胞中表现为生长迟缓，但在感染达48h之后，其峰值滴度与对照组病毒达相当水平。酶促反应动力学结果显示，与对照组相比，NA-H274Y毒株的Vmax值下降了一半以上，Km值增加了2.53倍，表明其NA对底物的亲和力下降。 5.NA的H274Y变异对H7N9病毒的致病性无明显影响，但I222T变异使得H7N9病毒对小鼠的致病力增强体内试验结果显示，H7N9NA-I222T毒株感染组小鼠的体重减轻更为显著，在第8天达到近30%，显著高于对照组水平；此外，NA-I222T毒株感染组小鼠在感染后第9天全部死亡，与Passage1毒株相比有显著性差异，提示NA-I222T毒株对小鼠的致病力增强。 综上所述，本研究系统性探讨了H7N9禽流感病毒在NA抑制剂帕拉米韦选择压力下的准种演变，并分析了这些演变特别是神经氨酸酶的变异对病毒多种生物学特性的影响。研究结果有助于我们从分子水平上探究H7N9禽流感患者在临床上接受抗病毒治疗后其体内H7N9病毒的可能变异趋势及发生机制，对于指导临床用药、预测病毒变异以及进一步研究其致病机制均具有重要意义。