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食源性致病菌对人类健康与公众安全造成了极大的危害,形成生物被膜加剧了它们的致病与耐药风险。酶具有高度专一性,可靶向作用于生物被膜中的特殊物质,从而清除食源性致病菌的生物被膜,具有重要的科研价值和广泛的应用前景。假单胞菌（Pseudomonas spp.）是常见的食源性致病菌与腐败菌,被视为生物被膜研究的模式菌株,广泛存在于各类食品及环境中,对食品安全和人类健康造成了严重的影响。Pel是一种由N-乙酰-D-氨基葡萄糖和N-乙酰基-D-半乳糖胺组成的阳离子胞外多糖,是假单胞菌生物被膜形成必不可少的成分,与该菌生物被膜厚度、粘附性和细胞聚集性密切相关。因此,如果针对假单胞菌Pel胞外多糖进行靶向抑制,能够彻底破坏其生物被膜的“核心骨架”,从根本上瓦解生物被膜的形成,从而有效地降低该菌的耐药风险。因此,本研究首先针对Pel多糖生物合成系统（PelABCDEFG）进行了生物信息学分析,发现Pel系统的伴侣蛋白PelA的N端含有1个糖苷水解酶结构域,具有靶向水解Pel胞外多糖的潜力。进一步对PelA的糖苷水解酶结构域进行了重组蛋白表达与纯化（本研究命名为PelAN）,探究了胞外多糖水解酶PelAN的酶学特性、安全性、以及对不同类型材料表面生物被膜的清除效果。并结合基因编辑技术,实现了胞外多糖水解酶PelAN靶向控制食源性假单胞菌生物被膜的作用机制研究。具体研究内容及研究结果如下:1.胞外多糖水解酶PelAN生物信息学数据的挖掘与分析本研究以3种常见假单胞菌（铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida））作为研究对象,通过生物信息学分析技术,结合Ex PASy在线工具、Signal P4.0Server、TMHMM-2.0、Phyre2等软件,分析了3种假单胞菌Pel胞外多糖转运系统相关蛋白PelA-G的理化性质、信号肽、跨膜区域以及三级结构和功能。结果表明,除Pel E和Pel G蛋白的理论等电点存在差异外,3种假单胞菌Pel系统的理化性质基本相同。荧光假单胞菌PelA蛋白不含跨膜区,铜绿假单胞菌Pel E蛋白比另外两种菌多1段跨膜区,其他蛋白的跨膜区不存在明显差异。本研究从生物信息学的角度揭示了3种假单胞菌Pel系统结构和功能上的共性,为该系统转运机制的进一步研究提供重要的数据基础。此外,发现Pel系统的伴侣蛋白PelA具有两个特异性的功能域,其N端含有1个糖苷水解酶结构域,C端含有1个碳水化合物脂酶结构域。这一研究结果表明,PelA不仅能够协助假单胞菌转运胞外多糖,还具备靶向水解Pel胞外多糖的潜力。2.胞外多糖水解酶PelAN的表达与纯化本研究进一步选取铜绿假单胞菌PelA的蛋白序列（第48-303位氨基酸）和荧光假单胞菌PelA糖苷水解酶域的蛋白序列（第37-288位氨基酸）,通过E.coli Codon Usage Analyzer 2.1对其密码子进行了优化,将优化后的序列克隆到含T7启动子的p ET-28b表达载体上,构建含6个N末端组氨酸残基的重组胞外多糖水解酶PelAN-PA和PelAN-PF。在20℃条件下,以0.2 m M IPTG诱导大肠杆菌BL21（DE3）细胞表达这两种酶。胞外多糖水解酶PelAN-PA和PelAN-PF用不同的Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,在含300m M咪唑的buffer中被洗脱下来。经AKTA纯化系统得到高纯度PelAN-PA和PelAN-PF蛋白。通过质谱鉴定,验证了获取的高纯度蛋白的确为胞外多糖水解酶PelAN-PA和PelAN-PF。结果表明,PelAN-PA和PelAN-PF蛋白具有质量好、纯度高和无明显聚集的优点。本章成功构建了胞外多糖水解酶PelAN-PA和PelAN-PF的表达纯化策略,获得了高纯度的PelAN-PA和PelAN-PF蛋白,为后续对胞外多糖水解酶PelAN清除生物被膜的作用效果及作用机制研究提供了高质量的研究材料。3.胞外多糖水解酶PelAN的酶学特性、安全性、作用效果及初步作用机制研究为了全面推广胞外多糖水解酶PelAN在食品工业领域的应用,本研究进一步探究了PelAN的酶学特性、安全性及作用效果,并初步揭示了其作用机制。结果表明,胞外多糖水解酶PelAN-PA和PelAN-PF的最适p H均为8.5,最适温度为40℃。对其安全性进行研究,发现两种胞外多糖水解酶均对巨噬细胞RAW254.7和人结肠上皮细胞系HT-29细胞没有任何毒性。进一步证明了降低酶体系中的Na Cl浓度,或添加外源金属螯合剂EDTA,均能提升该酶的作用效果。使用结晶紫染色法结合激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）和扫描电子显微镜（SEM）,定量分析该酶对不同材料（非生物材料:玻璃、不锈钢和聚丙烯;生物材料:芹菜、杏鲍菇和鱼鳞）表面假单胞菌生物被膜的抑制作用,结果表明,经胞外多糖水解酶PelAN处理后,铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌和恶臭假单胞菌生物被膜的生物量（BV）和平均厚度（MT）均明显下降,而粗糙度（BR）显著增加,有效抑制假单胞菌生物被膜的形成。最后,通过运用CAZymes Analysis Toolkit对胞外多糖水解酶PelAN-PA的酶活性位点进行预测,结果表明,位于PelA的第218位谷氨酸（E）是该酶的关键活性位点。对胞外多糖水解酶的活性具有至关重要的作用。本研究为假单胞菌生物被膜的精准控制提供了一种新型的靶向清除策略,有助于降低生物被膜的耐药风险,并切实保障食品质量安全。