目的:　　 动脉粥样硬化的主要的细胞学改变是动脉内膜的巨噬细胞及平滑肌细胞中大量胆固醇的聚集,形成泡沫化细胞。对于大多数细胞来说,基本都不代谢胆固醇或仅少部分转变成氧化固醇,因此需要某种机制将细胞内多余的胆固醇转移出细胞。胆固醇逆向转运(RCT)是机体排出多余胆固醇的唯一途径,RCT是指将肝外细胞及组织中的胆固醇转运至肝脏,并进一步通过胆汁、粪便排出体外的过程。在此过程中ABCA1是介导胆固醇及磷脂转运至含apoA-Ⅰ脂蛋白的主要转运体,因此具有重要的抗AS作用。ABCA1蛋白水平维持在一稳定水平,对ABCA1的功能的增强或抑制的调节主要在其基因启动子上。LXR、RXR、PPARs与其共激活因子共同作用结合至ABCA1启动子上相应顺式作用元件可上调ABCA1的表达。因此,LXR或者RXR等转录因子的小分子激活剂可成为上调ABCA1促胆固醇外排的一类药物。然而,LXR激动剂引起SREBP1c靶基因的上调,结果导致严重的脂肪肝以及高甘油三酯血症。因此,筛选直接作用于ABCA1新型促胆固醇外排的药物已成为抗AS药物的研究重点。　　 方法:　　 1.构建ABCA1启动子的报告基因:以小鼠基因组DNA为模板,克隆小鼠ABCA1基因启动子序列(-636 to+208 bp),将该片段插入到含萤火虫荧光素酶报告基因的质粒pGL3-Basic中,得到含小鼠ABCA1启动子序列的重组质粒。　　 2.上调ABCA1药物的筛选:通过脂质体转染法,将重组质粒pGL3-PA1与内参质粒phRL-TK共转染到RAW264.7细胞中。通过对报告基因系统优化后,利用该系统对人工合成的126个黄酮类、42个姜黄素类衍生物及部分上市的抗AS药物进行筛选。在药物作用24小时后,利用双报告基因检测试剂检测荧光素酶的活性。　　 3.为了进一步证实报告基因系统中候选化合物上调.ABCA1启动子的活性,采用实时定量RT-PCR和Western-Blot的方法检测部分候选化合物对ABCA1的mRNA水平及蛋白质水平的影响。　　 4.F87与F90对RAW264.7细胞中3H标胆固醇外排作用:oxLDL与3H标胆固醇共荷脂RAW264.7细胞24小时后,F87与F90再作用于荷脂RAW264.7细胞24小时,最后通过液体闪烁计数分别检测apoA-Ⅰ与HDL介导的胆固醇外排率。　　 5.F87与F90上调ABCA1启动子活性的机制:构建小鼠ABCA1启动子截断片段及LXRE突变的报告基因,利用双报告基因系统检测F87与F90在ABCA1启动子报告基因的转录活性。　　 6.F90对小鼠在体中胆固醇逆向转运的作用:24只C57BL/6小鼠给予普通饲料喂养3周,同时给予F90干预。之后,小鼠腹腔注射oxLDL及3H标胆固醇荷脂的RAW264.7细胞。第24小时,第48小时取血,液闪计数检测放射性活性。收集48小时内所有的粪便,液体闪烁计数检测放射性活性。最后取出肝脏,称量部分肝脏用于液闪计数检测放射性活性。第48小时取的血清用于酶法分析血脂。　　 7.F90对小鼠在体中胆固醇逆向转运相关基因的作用:实时定量PCR检测肝脏及小肠内胆固醇外排相关基因的表达水平。　　 8.阿司匹林上调ABCA1表达促进apoA-Ⅰ介导的RAW264.7细胞胆固醇的外排:定量PCR及Western Blot检测ABCA1的表达,检测阿司匹林对apoA-Ⅰ及β-MCD诱导RAW264.7细胞胆固醇外排的作用,PPARα-SiRNA转染细胞后检测RAW264.7细胞中ABCA1的表达及apoA-Ⅰ介导的胆固醇外排。　　 结果:　　 1.本研究成功构建了含小鼠ABCA1启动子序列(-636 to+208 bp)的荧光素酶报告基因的重组质粒pGL3-PA1。通过脂质体转染到RAW264.7细胞中,作为筛选药物的工具。　　 2.从126个合成的黄酮类、姜黄素及42个姜黄素衍生物中,我们发现在1.0×10-6M的浓度下,合成黄酮类中的F72、F73、F74、F78、F82、F85、F87、F90、F91、FM92、M103,姜黄素衍生物中D191和218能明显提高pGL3-PA1质粒的ABCA1启动子活性。上市抗AS药物中,我们发现1.0×10-6M的辛伐他汀、洛伐他汀、阿伐他汀以及0.5mM的阿司匹林也能轻度地上调ABCA1启动子的活性。　　 3.我们采用定量RT-PCR分析部分候选化合物对RAW264.7细胞ABCA1的mRNA水平的作用,发现其上调ABCA1 mRNA的作用跟其在双报告基因系统中上调ABCA1启动子活性的作用基本一致。我们发现F87和F90上调ABCA1的mRNA水平的作用比阳性药LXR激动剂GW3965的作用要强。通过Western-Blot分析,我们发现F87和F90呈剂量依赖性上调ABCA1的蛋白水平,同时对另一转运体ABCG1也有剂量依赖性地上调作用。　　 4.F87和F90剂量依赖性地增强apoA-Ⅰ及HDL诱导RAW264.7细胞中3H标胆固醇的外排。　　 5.F87和F90明显增加含LXRE报告基因的活性,而对LXRE突变的报告基因的活性没有作用。　　 6.与对照组相比,F90明显降低小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C),升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)。在注射细胞48小后,F90明显降低血清中3H标胆固醇的水平,但肝脏中及粪便中的放射性活性呈剂量依赖性地增高。　　 7.F90剂量依赖性增加小鼠肝脏中ABCA1、ABCG1、ABCG5、ABCG8与CYPA7的mRNA水平；F90剂量依赖性增加小鼠小肠中ABCA1、ABCG1、ABCG5与ABCG的mRNA水平。　　 8.阿司匹林能上调RAW264.7细胞ABCA1的表达及apoA-Ⅰ介导的胆固醇外排,而对β-MCD诱导的RAW264.7细胞胆固醇外排无明显影响,PPARα特异性干扰可抑制以上效应。　　 结论:　　 1.建立了pGL3-PA1双报告基因筛药系统,可用于从众多合成小分子化合物中筛选出上调小鼠ABCA1启动子活性药物的有力工具。　　 2.黄酮类化合物F72、F73、F74、F78、F82、F85、F87、F90、F91、FM92、M103,姜黄素衍生物D191和218能明显提高pGL3-PA1质粒的ABCA1启动子活性。　　 3.F87和F90可剂量依赖性地上调RAW264.7细胞ABCA1的mRNA水平,且作用比阳性药LXR激动剂GW3965的作用强。F87和F90可剂量依赖性地上调RAW264.7细胞ABCA1与ABCG1的蛋白水平。　　 4.F87和F90剂量依赖性地增强apoA-Ⅰ及HDL诱导RAW264.7细胞中3H标胆固醇的外排。　　 5.F87和F90上调ABCA1启动子的活性与LXRE有关。　　 6.F90明显降低小鼠血清中低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平,升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平,促进体内胆固醇的逆向转运。　　 7.F90具有上调小鼠肝脏及小肠中胆固醇外排相关基因表达的作用。拟作为治疗AS的先导化合物申请知识产权保护,并计划进一步规范的临床前评价。　　 8.阿司匹林通过上调RAW264.7细胞ABCA1的表达促进胆固醇外排,PPARα参与了此作用。