论文部分内容阅读
本文主要从以下几个部分展开论述： 实验一全反式维甲酸对LOVO和SW480结直肠癌细胞系增殖、凋亡及维甲酸受体表达的影响 背景与目的： 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)长期以来是肿瘤研究的热点之一。而以DNA微卫星重复序列长度改变为特征的微卫星不稳定型(microsatellite instability,MSI)CRC也越来越受到人们的关注。微卫星是指存在于人类基因组各部分的一组多次串联重复的DNA序列,以1-6个核苷酸为一个单位重复10-60次。该重复序列中包括5个核苷酸标记点,在这5个标记中,出现2个或者2个以上显示MSI则可诊断为高微卫星不稳定(microsatellite instable-high,MSI-H);出现1个显示MSI则诊断为低微卫星不稳定(microsatellite instable-low,MSI-L);5个标记点均没有显示MSI则可诊断为微卫星稳定(microsatellite stability,MSS)。MSS与MSI这两种特性的CRC提示着不同的发展趋势和愈后。 维甲酸(retinoic acid,RA),是维生素A的衍生物,对多种肿瘤细胞有着抑制生长,促进凋亡,诱导分化等作用。RA有着包括9-顺式维甲酸、13-顺式维甲酸以及全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)在内的多种顺反异构体。其中以第三代维甲酸ATRA结构最为稳定。ATRA只有与维甲酸受体(retinoic acid receptors RARs)结合才能有效地发挥其对肿瘤细胞抑制增殖、促进凋亡的作用。维甲酸受体包括RARs和维甲类X受体(retinoid X receptor,RXR)。RARs与RXR均参与RA信号的介导,并同样包括三种亚型α、β、γ。目前ATRA对CRC,尤其是MSS CRC和MSI CRC作用效果及差别并不明确。本文应用ATRA对MSI及MSS两种癌细胞进行不同浓度处理,并观察比较其增殖情况,RAR-αmRNA表达情况以及凋亡蛋白表达情况,以了解ATRA对MSI及MSS CRC的影响,为CRC发病机制研究及治疗方案的选择提供有益的科学依据,并间接了解ATRA对锯齿状病变发病机制的可能作用。 方法： 体外培养MSI细胞LOVO及MSS细胞SW480,并用不同浓度的ATRA进行处理,同时设置阴性对照组和RARs-α抑制剂对照组。MTT法分析两种细胞增殖变化,RT-PCR及平均光密度比值分析RAR-αmRNA表达情况,Western-blot技术测定及平均光密度比值分析细胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-8表达情况 结果： 1.MTT检测发现两种细胞加入ATRA后生长受到明显抑制;并且浓度越高抑制效果越明显;而加入RARs-α抑制剂后ATRA抑制效果明显降低;2.RT-PCR检测RAR-αmRNA表达情况。加入ATRA之后,两种细胞RAR-αmRNA表达较阴性对照组均明显增加,差别有统计学意义(P<0.05)。SW480 ATRA与LOVO ATRA比较差异有统计学意义(P<0.05),从平均光密度比值上看SW480细胞RAR-αmRNA表达高于LOVO细胞。而加入RARs抑制剂后两种细胞RAR-αmRNA表达较阴性对照组均无差别(P>0.05)3.Western-blot检测发现加入ATRA后两种细胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-8表达均较阴性对照组明显增加,差别有统计学意义(P<0.05),而加入RARs抑制剂后两种细胞凋亡蛋白caspase-3、caspase-8表达较阴性对照组均无差别(P>0.05)。两种凋亡蛋白SW480 ATRA与LOVO ATRA比较差异有统计学意义(P<0.05)。从平均光密度比值上看SW480细胞caspase-3、caspase-8表达均高于LOVO细胞。 结论： 1.ATRA对MSS特性CRC细胞和MSI特性CRC细胞均能起到有效地抑制增殖、诱导凋亡和刺激受体表达作用 2.ATRA对CRC细胞抑制增殖、诱导凋亡、促进 RARs表达的作用效果比较,MSS细胞要强于MSI细胞 3.RARs抑制剂能有效地抑制ATRA对肿瘤细胞的作用,说明ATRA只有与受体结合才能发挥作用。 4.ATRA对MSI及MSS癌细胞均具有抑制作用,应用ATRA受体抑制剂后抑制作用减弱,间接提示缺乏ATRA及维甲酸类物质可能与结直肠锯齿状病变发病有关。 实验二结直肠锯齿状病变伴浸润癌及高级别上皮内肿瘤的临床病理学观察 背景与目的： 结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤之一[1-2],新近研究提出,60％结肠癌来自普通腺瘤,35%来自锯齿状腺瘤,5%来自Lynch综合征[3]。2010年新版WHO消化系统分类中将结直肠锯齿状病变进行了较为详尽临床病理学及分子遗传学介绍,其定义为一组以上皮锯齿状结构为特征的病变,病变包括增生性息肉(hyperplastic polyp,HP)、广基锯齿状腺瘤/息肉(Sessile Serrated Adenoma/polyp,SSA/P)传统锯齿状腺瘤(Traditional Serrated Adenoma,TSA);并在结直肠癌亚型中分出锯齿状腺癌(Serrated Adenocarcinoma,SAC)[4-5]。一般认为HP为良性病变,SSA及TSA是锯齿状癌前病变,通过锯齿状分子遗传学及表观遗传学途径可发生癌变,即锯齿状癌变通路。锯齿状癌变通路包括具有MSI-L或MSS特性的传统锯齿状通路和具有MSI-H特性的广基锯齿状通路。由此可见锯齿状病变与MSI关系密切。而MSI产生的原因正是由于DNA错配修复(deficient mismatch repair,MMR)系统失活造成。MMR包括MLH1、PMS2、MSH2和MSH6四种基因,这四种基因尤其是MLH1突变会引起MMR基因的突变和与之对应的MMR蛋白无功能,进而造成MSI。而DNA修复基因MGMT突变也同样会引起MSI。本次研究中我们收集北京河北5所医院5年期间5347例结直肠息肉腺瘤,从中筛选出258例锯齿状病变,其中有16例表现为结直肠锯齿状病变伴浸润癌及高级别上皮内肿瘤(high-grade intraepithelial neoplasia,HIN)的病理学特点。我们对其临床病理学特点及MLH1,MSH2,K-ras,MGMT免疫组织化学表达进行观察分析,以期对锯齿状癌变有进一步的了解,为结直肠癌变途径的研究及临床预后管理提供依据。 方法： 收集北京军区总医院(2641例),解放军252医院(1321例),海军总医院(964例)、河北省巨鹿县医院(364例)、北京中医药大学东直门医院五所医院(57例)5年左右结直肠病理诊断为各类息肉和腺瘤切片共5347例。从中筛选出16例不同类型锯齿状病变伴有浸润性癌/HIN病例,其中TSA合并浸润性癌/HIN的为7例,SSA合并浸润性癌/HIN的为6例,HP合并浸润性癌/HIN为3例,并选20例大肠腺癌作为对照组。所选标本均进行免疫组化MLH1、MSH2、K-ras、MGMT染色。 结果： TSA合并浸润性癌/HIN好发于直肠,TSA腺体可见明显锯齿状结构和异位隐窝,纤维绒毛锯齿状腺瘤(Filiform Serrated Adenomas,FSA)异型增生程度较高,易癌变。SSA合并浸润性癌/HIN好发于回盲部,伴癌组织的SSA锯齿状改变腺体紧靠黏膜肌层,基底隐窝扩张,呈倒“T”或“L”型分枝。4例合并浸润性腺癌,3例浸润癌癌旁可见HP,其中2例可见HP-SSA/TSA-癌变移行过程。免疫组织化学显示MGMT在锯齿状病变组织、锯齿状病变所伴癌组织及大肠癌对照组的表达差异有统计学意义(P值分别为0.022、0.002)。 结论： 1.TSA、SSA可癌变或直接发展为浸润性腺癌,FSA易发展为HIN,进而浸润; 2.HP可为浸润癌的癌旁组织,紧靠癌组织,是否直接可癌变尚需进一步观察。 3.免疫组化结果显示锯齿状病变及2例SAC中MGMT无表达;SSA中MLH1无表达,提示锯齿状病变癌变确实存在不同分子通路。