研究背景和目的：前列腺癌是一种常见恶性泌尿系统肿瘤。据估计,在欧洲每年有32800个病人发生前列腺癌。虽然我国是前列腺癌的低发病区,但随着人群寿命的延长、饮食结构的改变和疾病监测意识的提高,前列腺癌的发病率逐年上升,并成为威胁我国老年男性生命的重要疾病。随着前列腺特异性抗原(PSA)在临床诊断上的广泛应用,前列腺癌的诊断及治疗已经取得长足的进步。前列腺癌根治术是目前最常用的治疗手段,但是25%-50%的病人发生术后PSA水平的升高,即生化复发。以往的研究表明,生化复发是前列腺癌患者局部临床复发及远期转移的前兆。因此,很有必要找到判断前列腺癌复发的特异性辅助指标。并且,进一步研究前列腺癌发病分子机制,发现新的有效的治疗手段,而减少肿瘤的复发与转移,具有重要的科学意义。microRNA (miRNA)是一种非编码的短链RNA,它可以通过降解靶基因或抑制靶基因翻译来实现转录后的基因沉默。miRNA在肿瘤中异常表达,并通过对下游靶基因调控,在肿瘤发生及发展中行使着癌基因或抑癌基因的功能。miRNA在肿瘤中的作用主要在细胞增殖、侵袭、转移、细胞调亡、血管生成、干细胞调控、上皮间质转化及药物耐受等方面。我们前期已经进行前列腺癌miRNA表达谱研究,获得前列腺癌特异性表达的miRNA分子列表(GEO编号：GSE34932),其中miR-30c是前列腺癌中下调最明显miRNA之一。我们推测miR-30c可能在前列腺癌发病机制中起着重要抑癌基因的作用。miR-30c参与许多疾病的调控,包括镰刀型贫血中纤溶酶原激活物抑制剂的调节、心肌梗塞中心肌结缔组织的重组及糖尿病中脂肪细胞的分化等。miR-30c在肿瘤中可能下调,也可能上调,而它与肿瘤发生、发展的关系以及内在调控机制尚在研究中。Nat Med报道了非小细胞肺癌中,miR-30c影响肺癌细胞对肿瘤抗血管生成药物的抵抗及促进上皮间质的转化过程(EMT),加速肺癌的发病进程。miR-30c还能加强自然杀伤细胞(NK细胞)的毒性而抑制肝癌的发展。在肿瘤中,miR-30c也调控细胞的增殖及转移。在临床预后方面,研究表明niR-30c与肺癌、乳腺癌密切相关。然而,miR-30c对前列腺癌的功能及临床作用未见相关报道。本研究首先运用qRT-PCR检测miR-30c在前列腺癌细胞及组织的表达情况,阐述其在前列腺癌发病进程的作用：进而结合临床样本分析等方法,阐明miR-30c影响前列腺癌的发病进程及临床预后的关系。通过质粒转染及细胞功能实验,获得miR-30c调控前列腺癌增殖、侵袭及转移的可靠证据；本研究的顺利实施,将为前列腺癌的防治提供新思路和新靶点。材料：QRT-PCR的样本均为2002年到2012年广州市第一人民医院泌尿外科前列腺癌根治术后的样本。前列腺癌样本分别为103例,良性组织样本为28例。液氮速冻收集保存。术后均经病理证实为前列腺癌。3种前列腺癌细胞株(PC3/DU145/LNCaP)及正常细胞株RWPE-1是从American Type Culture Collection公司(Manassas, VA, USA)购买的。方法：QRT-PCR检测miR-30c在前列腺癌细胞及组织的表达情况。提取3种前列腺癌细胞(PC3/DU145/LNCaP)、1种正常细胞RWPE-1、103例前列腺癌组织及28例良性组织的miRNA,逆转录成cDNA后,采用SYBR green法进行荧光定量PCR扩增,U6为内参对照,通过相对定量方法,以2-△△CT值代表基因的相对表达强度。细胞增殖实验检测miR-30c对前列腺癌细胞增殖力的影响。用培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200u1。培养12h、24h、48h及72h后,每孔加CCK8溶液20u1。继续孵育4小时,终止培养,离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值(OD),记录结果。以时间为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制细胞生长曲线。Transwell实验检测miR-30c对前列腺癌细胞侵袭力的影响。按照Chemicon公司的ECM550系列说明书要求,将小室放入培养板中,在上室加入300μ1预温的无血清培养基,室温静置15-30分钟,基质胶水化,再吸去剩余培养液。24孔板下室一般加入500μ1含血清或趋化因子的培养基。然后,制备细胞悬液接种细胞。Leica DC300F正置显微镜进行观察、拍照及侵袭细胞定量分析。划痕试验检测miR-30c对前列腺癌细胞转移力的影响。取对数生长期的细胞,置于24孔板,细胞密度8x104/孔,每组设三个复孔,待细胞呈现单层贴壁生长时,用l0u1的消毒枪头在24孔板垂直划痕,并划好标记,然后用无血清培养基洗2-3次,尽量将划掉的细胞清洗掉,换无血清培养基,37度、5%C02培养箱继续培养,于0h、48h在相差显微镜下随机选择5个40倍视野内测量划痕面垂直距离。实验重复三次。统计学处理：所有实验数据均用均数±标准差表示,数据统计用SPSS17.0统计软件包处理。One-way ANOVA检验分析各细胞株中miR-30c的表达情况,两两比较采用Bonferroni法；MTT实验的数据比较采用析因设计的方差分析；卡方检验分析前列腺癌组织中的miR-30c表达与患者临床病理参数之间的关系,运用Kaplan-Meier方法及Log-rank检验对无生化复发生存率分析。Cox风险回归模型进行多因素分析miR-30c及其它临床病理资料对无生化复发生存率的危险程度；其他实验采用独立样本的t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。结果：1.我们前列腺癌miRNA芯片结果表明,miR-30c是下调比较显著的miRNA分子(倍数变化=2.09倍,t=-3.65,P=0.016)。2.采用3种前列腺细胞(DU145/LNCaP/PC3)及1种正常细胞RWPE-1, qRT-PCR检测miR-30c的表达情况。同正常细胞RWPE-1相比,结果表明PC3、DU145及LNCaP均下调表达(表达倍数变化分别为1.85,2.04及3.12,P<0.05)。3.我们采用103例前列腺癌组织及28例良性组织样本,检测miR-30c表达情况。QRT-PCR结果表明miR-30c在前列腺癌组织的表达显著低于良性组织(3.27±0.62vs.6.85±0.33, t=7.53, P<0.001)。4.根据miR-30c的相对表达量,以中位数3.36将其分为低表达组及高表达组,从而进一步分析miR-30c与临床预后的关系。结果表明,miR-30c的表达量同Gleason评分(X2=9.338,P=0.009)、病理分期(X2=5.806,P=0.016)、转移(x2=6.690,P=0.010)及生化复发(X2=4.513,P=0.034)显著相关,即Gleason评分低组、病理分期低组、无转移、无生化复发的患者中的miR-30c表达水平更高。而它的表达水平同术前PSA水平(x2=3.104,P=0.078)及切缘性质(x2=0.566,P=0.452)无显著相关。5.经Log-Rank检验,miR-30c低表达与无生化复发生存率显著负相关(X2=5.201, P=0.023)。miR-30c低表达组的中位生化复发时间为110.16月,高表达组在研究期间内尚未观察到一半的患者出现生化复发,故未能得到其中位生化复发时间。高表达组的生化复发时间显著高于低表达组(平均生化复发时间分别为105.74及80.69月)。miR-30c高表达及低表达组的5年无生化复发生存率分别为85.1%及60.4%。6.我们进一步确定miR-30c是否为预测前列腺癌患者无生化复发生存率的独立预后因素,采用Cox风险比例回归模型进行单因素及多因素的综合分析。单因素及多因素分析均表明,miR-30c表达越低(HR=0.31,P<0.001),Gleason评分越高(HR=3.62, P<0.001),术前PSA越高(HR=1.00,P=0.011),病理分期越高(HR=4.95,P<0.001),及手术切缘阳性(HR=2.39,P<0.043),则生化复发的风险越大。多因素分析表明miR-30c表达水平(HR=0.34, P=0.002)、Gleason评分(HR=2.41,P=0.001)及病理分期(HR=3.69,P=0.010)是预测前列腺癌生化复发的独立预后因素,即miR-30c表达越低,生化复发危险性越高；Gleason评分越高,生化复发危险越高；病理分期T3-T4生化复发的危险性是T2期的3.69倍。7. LNCaP/DU145瞬时转染质粒48h后,miR-30c的表达水平显著高于阴性对照组(Du145：倍数=4.32,t=4.35,P<0.001：LNCaP:倍数=3.87,t=3.98,P<0.001)。8.在细胞增殖实验中,发现各时间段转染24h、48h、72h转染质粒后,miR-30c及对照组间有显著差异(F=2397.15,P<0.001),即LNCaP/DU145实验组的细胞生长速度显著慢于对照组(图9-10)。这结果表明,miR-30c过表达可抑制前列腺癌细胞增殖。9. Transwell侵袭实验表明,miR-30c转染组,LNCaP/DU145细胞侵袭的数量显著低于对照组(LNCaP:67vs.120个/视野,t=2.589,P<0.001：DU145:130vs.220个/视野,t=3.706,P<0.001),这说明,miR-30c能够抑制前列腺癌细胞的侵袭。10. Wound healing结果还发现miR-30c转染48h后,LNCaP/DU145细胞实验组转移的数量显著低于对照组(LNCaP:241vs.520个/视野,t=3.65, P<0.001; DU145:490vs.660个/视野,t=2.97,P<0.001),从而表明,miR-30c能够抑制前列腺癌细胞的转移。结论：1. miR-30c可能起着抑癌基因的作用,根据其表达差异,可鉴别前列腺癌及良性组织。2. miR-30c表达失调与前列腺癌的发病进程密切相关,可以通过检测它们在组织的水平可初步预测前列腺癌的进展以及判断前列腺癌的恶性程度。3.通过检测前列腺癌患者miR-30c的表达情况,可预测早期生化复发的概率及危险度。4. miR-30c它可抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭及转移,这说明miR-30c确实起着抑癌基因的作用。5. miR-30c可能通过KRAS-MAPK信号通路抑制前列腺癌增殖、侵袭及转移。