前言　　 肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71),属于小RNA病毒科(Picomaviridae)肠道病毒属的单股正链RNA病毒。1974年Schmidt等首次报道,从美国加利福尼亚州20例具有中枢神经系统症状患者(1969～1973年)标本中分离到EV71。如今已经在全球范围内引起十多次大的爆发流行,感染蔓延到全世界,尤其是近年来在亚太地区的发病率呈上升趋势。国内1981年在上海首先发现,迄今北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、西宁、广东、厦门、辽宁、武汉、香港等二十几个省市均有报道。　　 EV71对脊髓前角细胞具有特殊的组织嗜性,是引起急性弛缓性麻痹(AcuteFlaccid Paralysis,AFP)的非脊灰肠道病毒(Non-polio Fmterovirus,NPEV)最常见的病原体。近年来的流行病学资料显示,EV71与手足口病(Hand,foot and mouthdisease,HFMD)的暴发流行关系密切,并可导致无菌性脑脊髓膜炎、脑炎、心肌炎和脑麻痹后遗症等严重并发症,甚至导致死亡。国外报道EV71感染并发严重疾病的发生率<0.3％,国内则有高达1.69％的报道。早期诊断和治疗对于防止并发症的发生及患者的预后关系重大。因此,快速、特异、简捷的病毒感染检测方法成为临床上的迫切需要并受到高度重视。　　 环介导等温扩增技术(loop-mediated isotherm amplification,LAMP)是Notomi等2000年建立的一种新的核酸扩增方法。其原理是利用一种链置换DNA聚合酶(BstDNA polymerase)和两对特殊的引物,特异地识别靶序列上的6个独立区域,在等温条件下(65℃左右)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。反应结果可直接靠扩增副产物焦磷酸镁的沉淀浊度进行判断,也可以由添加SYBR Green I、溴化乙啶(EB)或其它核酸染剂进行呈色后观察。其优点是特异性强,扩增效率高,反应灵敏,操作简单。因而被国内外学者应用到多种细菌及病毒的基因检测中。目前尚未检索到使用该技术检测EV71的报道。本文针对EV71的病毒衣壳蛋白VP1基因序列设计3对特异引物,建立并优化了检测该靶序列的RT-LAMP扩增体系,同时对其特异性和敏感性进行了验证。应用该技术对辽宁省临床诊断HFMD患者标本进行了EV71基因检测,并与逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及荧光定量PCR(Real-time PCR)方法进行了比较分析。旨在为临床EV71感染诊断寻求快速、简便、可行的新方法。　　 方法　　 一、引物设计与合成　　 从GenBank下载EV71的VP1基因序列,应用DNAStar分析其基因序列,利用日本荣研公司LAMP Primer Explorer 4引物设计软件在序列的保守区域筛选出6条引物。对其引物进行序列BLAST分析,确定为EV71特异性引物。引物由上海生工公司合成,ddH2O溶解后分装,-20℃冰箱保存备用。　　 二、标本收集与处理　　 收集2009年辽宁省内297例临床诊断HFMD患者粪便或咽试标本,其中239份接种Vero细胞,待产生细胞病变(Cytopathic effect,CPE),收集病毒液后提取核酸；44份粪便及14份咽拭标本直接提取核酸。　　 三、核酸提取及保存　　 采用QIAGEN公司RNeasy mini kit核酸提取试剂盒,按照该公司提供的操作程序进行RNA核酸抽提。将抽取后RNA立即置-70℃保存备用。　　 四、RT-LAMP实时监控　　 为确立最佳反应条件我们对RT-LAMP反应体系进行了优化。在反应体系中加入SYBR Green I荧光染料,对提取的核酸进行RT-LAMP扩增,放入荧光定量PCR仪60℃反应80分钟,荧光检测后对扩增产物进行溶解曲线分析。最后对检测数据进行整理分析。　　 五、RT-LAMP的灵敏度及特异性测试　　 为评价该技术的特异性,我们使用设计的特异引物同时对轮状病毒、柯萨奇病毒A16、诺如病毒、札如病毒、EV71及星状病毒核酸进行RT-LAMP扩增。将RT-PCR等方法确证后的EV71 RNA模板进行10倍系列稀释至1.0×10-1～1.0×10-6等6个稀释度,进行灵敏度检测。同时与Real-time PCR及RT-PCR方法的灵敏度进行比对。　　 六、标本检测　　 应用本文所建立RT-LAMP方法检测上述标本,并同时与RT-PCR及Real-timePCR方法的检测结果进行比较分析。　　 结果　　 一、RT-LAMP方法特异性　　 本文所设计的针对EV71基因的3对引物只与EV71 RNA反应,而与轮状病毒、柯萨奇病毒A16、诺如病毒、札如病毒、星状病毒核酸无交叉反应,表明该引物具有较高的特异性。而且对扩增产物的溶解曲线分析也进一步验证了扩增反应的特异性。　　 二、敏感性　　 将临床标本EV71 RNA稀释至1.0×10-1～1.0×10-6等6个稀释度,RT-LAMP扩增结果显示了典型的扩增带型且信号依次减弱,最低检测浓度为10-5。RT-PCR及Real-time检测方法的最低检测浓度为10-4,可见三种方法中RT-LAMP灵敏度最高。　　 三、标本检测结果　　 细胞培养物的x2检验分析结果显示RT-LAMP方法与其他两种方法相比在咽拭标本细胞培养物的检测中无明显差异(p>0.05),而在粪便标本细胞培养物的检测中RT-LAMP方法与RT-PCR方法的检出率无明显差异(p>0.05),高于Real-time PCR方法的检出率(p<0.05)。　　 对未经处理临床标本而言,总样本分析结果显示RT-LAMP与Real-time PCR方法的检出率呈现良好的一致性(p>0.05),高于RT-PCR方法(p<0.05)。分别对咽拭标本和粪便标本进一步分析,对于咽拭标本而言,RT-LAMP与Real-time PCR、RT-PCR方法的阳性检出率均无明显差异(p>0.05)。但对于粪便标本,RT-LAMP与Real-time PCR方法的阳性检出率无明显差异(p>0.05),高于RT-PCR方法的阳性检出率(p<0.05)。　　 讨论　　 首先在引物设计上选择VP1蛋白,该蛋白具有最多的型特异性中和位点,可提供最可靠的分子流行病学信息,也是目前基因分型最多采用区域。在该区域设计三对引物,可特异地识别靶序列上的8个特定区域,而且只有当引物与8个区域严格配对时靶序列才会得到大量的扩增,所以该反应具有很高的特异性,不易受到非靶序列DNA存在的影响。其次RT-LAMP的特异性试验中,成功检测了EV71基因,对轮状病毒等其他肠道病毒核酸无扩增,并且对扩增产物的溶解曲线分析试验也进一步证明RT-LAMP反应的特异性。　　 将临床标本EV71 RNA稀释至1.0×10-1～1.0×10-6等6个稀释度,RT-LAMP扩增结果显示了典型的梯形扩增带型且信号依次减弱,最低检测浓度为10-5。RT-PCR及Real-time检测方法的最低检测浓度为10-4,可见三种方法中RT-LAMP灵敏度最高。　　 对于细胞培养物进行x2检验分析,结果显示RT-LAMP方法与其他两种方法相比对咽拭标本细胞培养物的检测中无明显差异(p>0.05),而对粪便标本细胞培养物的检测中RT-LAMP与RT-PCR方法的阳性检出率无明显差异(p>0.05),高于Real-time PCR方法的阳性检出率(p<0.05)。这可能与粪便标本的病毒含量高于咽拭标本,而且经过细胞培养后病毒量剧增,从而影响了荧光信号的检出,造成假阴性有关。　　 对未经处理临床标本进行x2检验分析,总样本分析结果显示RT-LAMP与Real-time PCR方法的阳性检出率呈现良好的一致性(p>0.05),高于RT-PCR方法(p<0.05)。其中咽拭标本的分析结果显示RT-LAMP与其它两种方法的阳性检出率均无明显差异(p>0.05)；而粪便标本的分析结果显示RT-LAMP与Real-time PCR方法的阳性检出率无明显差异(p>0.05),高于RT-PCR方法的阳性检出率(p<0.05)。对于咽拭标本分析显示三种方法的阳性检出率无差别,这可能与咽拭标本较少(14份)有关,在进行统计学分析时会产生偏差。　　 结论　　 本研究建立的RT-LAMP方法在检测HFMD患者粪便及咽试标本EV71基因中获得了较理想的效果:其阳性检出率与Real-time PCR结果呈现良好的一致性,高于传统RT-PCR方法的阳性检出率。而且检测过程体现其快速、敏感、特异和成本低等优势。